一、 定量PCR的基本原理： 在PCR實驗條件下（Mg++、緩沖液、Taq酶、dNTP、引物、模板），經(jīng)變性→退火→延伸的一個循環(huán)，引物在退火階段與相應的模板結合，在延伸階段進行復制，此時產(chǎn)物為：Yn=Yn-1×(1+Ev) ,Yn:n個PCR循環(huán)后PCR產(chǎn)物的分子數(shù)；Yn-1:為n-1個熱循環(huán)后PCR產(chǎn)物的分子數(shù)；Ev:為擴增效率,0≤Ev≤1；若n個熱循環(huán)中其Ev是一致的話，經(jīng)n個循環(huán)后的擴增產(chǎn)物的分子數(shù)（Y）和反應物中原始分子數(shù)（X）之間關系，可描述為：Y=x×(1+ Ev)n。 1. 終點法定量原理： 在最佳實驗、循環(huán)次數(shù)n一定、Ev相同的前提下，根據(jù)擴增產(chǎn)物的量可以計數(shù)出反應物中原始分子數(shù)，若核酸提取效率相同（與標準品），進而計算出標本中靶分子的準確含量，即： lnx=lnY-n×ln(1+Ev)=lnY - b (b為常數(shù)) 2. 實時檢測法定量原理： 在最佳實驗、相同Ev以及相同擴增產(chǎn)物的情況下，反應物中原始分子數(shù)（X）與其所需要的擴增循環(huán)次數(shù)（n）成反比，若核酸提取效率相同（與標準品），進而計算出標本中靶分子的準確含量，即： LgX=LgY–n×Lg(1+Ev)=b - n×a (a、b為常數(shù))3. 擴增效率（Ev）的影響因素： 以上所述的定量原理均假定反應體系中擴增效率是不變，但是，實際上，Ev在不同的擴增管之間和同一擴增管的不同循環(huán)次數(shù)之間是不同，如何控制及解決Ev的變異以及標本制備的可靠性是PCR定量的可靠性所在，也是定量PCR的發(fā)展方向，那么，Ev的影響因素有： a. 引物和靶序列的結合能力（G+C%及突變），擴增產(chǎn)物的長度，G+C含量。 b. 模板的含量、DNA聚合酶、反應液成分變化。 c. 不同臨床標本間DNA聚合酶抑制物的存在情況。 d. 循環(huán)擴增儀上不同位置的差異。 二、 定量PCR方法的分類： 目前對標本的靶DNA或基因的相對或絕對含量是不同樣品的PCR產(chǎn)量檢測而推算出來，根據(jù)標本中是否加入內(nèi)標物，將分成以下兩種： （一） 外標法定量PCR： 一個已知含量的標準品（通常用質粒）經(jīng)一系列的稀釋后與待檢標本一起進行擴增，制作PCR擴增產(chǎn)物和靶核酸含量的標準曲線，根據(jù)待檢標本的擴增產(chǎn)物量即可推算出靶核酸的絕對含量；上述已提及不同標本間的擴增效率（Ev）的差異，對樣本間PCR產(chǎn)量作比較會產(chǎn)生很不準確的結果；以外還應考慮“平臺效應”對結果的影響，因為“平臺期”PCR產(chǎn)物量并不受初時模板量的影響；導致結果的準確性和重復性差，因此采用外標法應該注意： a、 注意標準化操作，優(yōu)化最佳實驗條件，減少標本間Ev的差異導致對結果的影響。 b、 標準品的稀釋因存在隨機分布而導致結果的不準確。 c、 注意“平臺效應”對實驗結果的影響。特別是后面提及的終點法檢測PCR產(chǎn)物的方法中。 d、 由PCR方法很靈敏，特別RT-PCR方法，沒有內(nèi)標存在的情況下，標本的污染而對實驗結果產(chǎn)生很大的影響。 e、 標本處理對結果的影響。 （二） 內(nèi)標法定量PCR： 由于上述提及的外標法存在不同標本間的Ev差異和標本的提?。ㄌ貏e是RT-PCR）的微小變化都將導致擴增產(chǎn)物的巨大差異。為了清除此種影響，國內(nèi)外都推重采用內(nèi)標法。內(nèi)標法是用PCR技術進行準確定量的基礎和今后的發(fā)展方向，根據(jù)采用內(nèi)標品的不同，又分為非競爭內(nèi)標定量PCR（quantitative PCR with noncompetitive intenal standands）和競爭定量PCR（competitive quantitative PCR）