一、試劑準備 1、新鮮配制冷的 RIPA 裂解緩沖液: ? ?? ?150 mM NaCL ? ?? ?1% NP-40 (去垢劑)? ? ? ?? ?0.1% SDS (去垢劑) ? ?? ?2ug/ml Aprotinin (蛋白酶抑制劑) (使用前加入) ? ?? ?2ug/ml Leupeptin (蛋白酶抑制劑) (使用前加入) ??1 mM PMSF (蛋白酶抑制劑) ??1.5 mM EDTA (蛋白酶抑制劑) ??1mM NaVanadate (磷酸脂酶抑制劑)(任選) ??以上所有試劑均按比例溶于150 mM NaCL溶液中。 2、冷的PBS 中加入 1 mM PMSF ? ?? ?? ?? ?? ?? ? 1.5 mM EDTA ? ?? ?? ?? ?? ?? ? 1mM NaVanadate （釩酸鈉）(任選) 3、對數(shù)期生長狀態(tài)佳的細胞，75cm至少3-4瓶（90%以上生長面積）。 二、實驗步驟 1、將長滿細胞的培養(yǎng)瓶放置在冰上， 用吸液管吸出培養(yǎng)液。加入足夠的冷的 PBS在培養(yǎng)瓶中充分洗滌細胞表面，以洗去瓶中殘留的培養(yǎng)基，倒掉PBS ，重復(fù)以上操作2-3遍。在最后一次洗滌中盡可能吸干殘留的PBS，盡量在冰上操作。 2、? ? ? ? 向培養(yǎng)瓶中加入冷的RIPA 裂解緩沖液 (每75cm2 培養(yǎng)瓶加1ml). 然后用細胞刮子沿著瓶壁開始刮細胞，如果所需要刮的同種細胞有多瓶，則將第一瓶刮下的細胞液吸出轉(zhuǎn)入下一瓶中繼續(xù)刮 (由于處理后的細胞裂解液較粘稠，所以宜用直徑大點的吸液管吸取)。 3、? ? ? ???吸出刮好的細胞裂解液置于14ml 離心管中 （置于冰上），然后重復(fù)步驟2以刮取剩下的細胞。 4、? ? ? ? 盡可能將多的細胞裂解液收集到14ml的離心管中，樣品插入冰盒進行超聲，超聲強度以不產(chǎn)生泡沫為準，超聲每次2-3秒，重復(fù)3-4次。如仍有細胞碎片或沉淀，應(yīng)離心10000rpm,10分鐘，留取上清。 5、? ? ? ? 取出小量細胞裂解液測其蛋白濃度（用Biorad Bradford 試劑盒或紫外分光光度計，在A280測定），分裝保存在 -70℃。