反相色譜（reversed phasc chromatography, RPC）是基于溶質(zhì)、極性流動相和非極性固定相表面間的疏水效應(yīng)建立的一種色譜模式，任何一種有機分子的結(jié)構(gòu)中都有非極性的疏水部分，這部分越大，一般保留值越高，在高效液相色譜中這是應(yīng)用面最廣的一種分離模式，在生物大分子的反相液相色譜條件下，流動相多采用酸性的、低離子強度的水溶液，并加一定比例的能與水互溶的異丙醇、乙腈或甲醇等有機改性劑，大量使用的填料為孔徑在30納米以上的硅膠烷基鍵合相，除此之外，也有少量高聚物微球。實驗表明，烷基鏈長對蛋白質(zhì)的反相保留沒有顯著的影響，但在蛋白質(zhì)的活性回收上短鏈烴基（如C₄，C₈，苯基）和長鏈烷基（如C₁₈，C₂₂）反相填料是有區(qū)別的。表現(xiàn)在烷基鏈越長，固定相的疏水性越強，因而為使蛋白質(zhì)較快洗脫下來，需要增加流動相的有機成分。過強的疏水性和過多的有機溶劑會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的不可逆吸附和生物活性的損失?？偲饋碚f，在烷基鍵合硅膠上的反相色譜，由于其柱效高、分離度好、保留機制清楚，是蛋白質(zhì)的分離、分析、純化和結(jié)構(gòu)闡明廣泛使用的一種方法。

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由于在反相色譜中，使用了乙腈、甲醇等價格高且有一定毒性的試劑，在一定程度上使該方法的使用受到限制。例如可使部分蛋白失活。因此，該方法用在分析鑒定方面更多一些，特別是對有機溶劑具有耐受性的樣品。例如多肽樣品，可用HPRPC對合成的肽huBPP進行分析。

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（一）實驗?zāi)康?/strong>
用HPRPC對huBPP進行純度鑒定。

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（二）材料和試劑

1，儀器：高效液相色譜儀，Beckman公司gold system.

2，色譜柱：⑴ 名稱：Diamonsil TM（鉆石） C18柱，5цm

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ⑵ 規(guī)格：250×4.6mm

3，試劑：甲醇（HPLC級）、三氟己酸（TFA）、乙腈 ?（HPLC級）、雙蒸水

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（三）樣品準(zhǔn)備
取待分析的huBPP，稱量，用0.1%的TFA液溶解，配制成濃度大于1mg/ml的液體。必要時過濾或離心。

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（四）操作

1、液體準(zhǔn)備：A液0.1%TFA，B液液，99.9%乙腈，0.1%TFA，脫氣。

2、開機

3、上柱

4、輸入?yún)?shù)

檢測波長 ?245nm

流速 ?1ml/min

流動相： A液：0.1%TFA

? ? ? ? ? ? ? ? B液：99.9%乙腈-0.1%TFA

洗脫條件：0-100% B ?20min

5、平衡色譜柱 ?一般反相柱都保存在甲醇中，應(yīng)置換出甲醇，用A液平衡色譜柱，待基線平穩(wěn)后準(zhǔn)備上樣。必要時，可按洗脫條件不上樣運行一遍程序，以洗出色譜柱可能存在的雜質(zhì)。

6、上樣，取20цl樣，注入上樣閥，將閥門扳下，即上樣。

7、進行分離，鑒定。

8、打印結(jié)果，并分析，可得到峰數(shù)，峰高，面積百分比，保留時間等參數(shù)。

9、用B液洗柱5min，若不再使用時，換成甲醇，洗滌后保存。