新抗新冠病毒藥物潛在作用靶點(diǎn)—新冠病毒包膜蛋白
新冠病毒已經(jīng)感染超過1.5億人次，并導(dǎo)致300多萬人死亡，然而迄今尚無用于新冠肺炎的特效藥物。新靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)和確證對于抗新冠病毒藥物研發(fā)具有重要意義。
2021年6月10日，中科院上海藥物所高召兵、李佳、沈敬山，以及武漢病毒所張磊砢、昆明動(dòng)物所鄭永唐聯(lián)合研究團(tuán)隊(duì)在Cell Research 發(fā)表了題為SARS-CoV-2 envelope protein causes acute respiratory distress syndrome (ARDS)-like pathological damage and constitutes an antiviral target 的研究論文，報(bào)道了一個(gè)新抗新冠病毒藥物潛在作用靶點(diǎn)—新冠病毒包膜蛋白（SARS-CoV-2 envelope protein，2-E）通道。該論文首先證明了新冠病毒包膜蛋白可形成一種酸敏感陽離子通道，且實(shí)驗(yàn)顯示該通道本身可導(dǎo)致細(xì)胞死亡、促進(jìn)炎癥因子釋放及小鼠ARDS樣損傷，進(jìn)而通過活性篩選與結(jié)構(gòu)優(yōu)化發(fā)現(xiàn)了多個(gè)在動(dòng)物模型上兼有預(yù)防和治療作用的小分子通道抑制劑。值得指出的是，疫情暴發(fā)伊始，研究團(tuán)隊(duì)即開展聯(lián)合攻關(guān)，并基于其在離子通道和病毒研究方面的積累，很快證明了包膜蛋白形成離子通道并具有成為新型藥物作用靶點(diǎn)的潛力，于2020年6月以預(yù)印本形式發(fā)表了部分工作。
包膜蛋白2-E形成新型陽離子通道
新冠病毒包含刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜糖蛋白(M)、核衣殼蛋白(N)共4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白。包膜蛋白（E）是其中最小的結(jié)構(gòu)蛋白，長約75個(gè)氨基酸，其蛋白本質(zhì)和生理病理功能尚不明確。其它冠狀病毒E蛋白的研究顯示該類蛋白具有離子通道活性，但將其作為干預(yù)靶點(diǎn)的研究較少報(bào)導(dǎo)。
該研究中高召兵研究團(tuán)隊(duì)與合作者將純化的包膜蛋白2-E重組于人工脂質(zhì)雙分子層上，首次獲得了由2-E介導(dǎo)的單通道電流，證實(shí)其為離子通道；通過改變記錄的內(nèi)外液條件，發(fā)現(xiàn)2-E通道為陽離子通道，可以通透單價(jià)陽離子鉀、鈉和二價(jià)陽離子鈣、鎂；采用同時(shí)改變內(nèi)外液pH并結(jié)合質(zhì)子滴定的方法，首次證實(shí)隨著內(nèi)外液pH值的降低，2-E通道電導(dǎo)與開放概率逐漸升高，通道活性增強(qiáng)。以上結(jié)果表明，SARS-CoV-2-E能夠形成pH值敏感的非選擇性陽離子通道。值得指出的是，有研究發(fā)現(xiàn)新冠病毒可通過酸化溶酶體、改變酶活性從而從胞內(nèi)釋放；在感染新冠病毒的重癥患者體內(nèi)，也存在嚴(yán)重的離子失衡，與包膜蛋白2-E蛋白形成酸敏感離子通道可能具有一定關(guān)聯(lián)性。
包膜蛋白2-E通道誘發(fā)宿主細(xì)胞死亡與體內(nèi)炎癥風(fēng)暴
新冠病毒感染患者體內(nèi)發(fā)生細(xì)胞因子風(fēng)暴，出現(xiàn)肺泡損傷、水腫、出血、間質(zhì)炎性浸潤，重癥患者會(huì)出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）。在細(xì)胞水平，研究團(tuán)隊(duì)通過在不同種屬來源與不同類別的細(xì)胞系中表達(dá)2-E通道，發(fā)現(xiàn)其通道功能可誘導(dǎo)宿主細(xì)胞發(fā)生死亡；通過2-E直接表達(dá)、2-E蛋白刺激以及巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的方式發(fā)現(xiàn)2-E通道蛋白可誘發(fā)體外炎癥分泌。進(jìn)一步研究顯示，2-E蛋白在小鼠體內(nèi)可誘導(dǎo)TNF-α、IL-6以及趨化因子CXCL9、CCL12的表達(dá)水平顯著上升，以及肺組織發(fā)生ARDS樣損傷，與COVID-19患者體內(nèi)所觀察到的現(xiàn)象具有一些相似性。
包膜蛋白2-E通道參與SARS-CoV-2病毒復(fù)制
研究團(tuán)隊(duì)采用丙氨酸突變掃描技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)顯性負(fù)突變2-EF4A與2-ET11A。與野生型2-E對比，這兩個(gè)突變通道活性較低；轉(zhuǎn)染細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，突變組的病毒基因拷貝數(shù)顯著降低；體內(nèi)外給予突變通道蛋白，其導(dǎo)致的炎癥因子釋放和ARDS樣損傷亦顯著降低。以上結(jié)果顯示包膜蛋白2-E的通道活性在SARS-CoV-2病毒組裝和釋放以及引起宿主損傷過程中發(fā)揮重要作用。
包膜蛋白2-E通道抑制劑在動(dòng)物模型上可預(yù)防和治療SARS-CoV-2感染
依托上海藥物所離子通道研究平臺研究團(tuán)隊(duì)開展了通道抑制劑的篩選和發(fā)現(xiàn)工作，從數(shù)千種老藥、天然產(chǎn)物中挑選出BE系列化合物進(jìn)行深入研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BE系列化合物在通道抑制活性、細(xì)胞保護(hù)作用和抗病毒活性方面有著較好的正相關(guān)性，從而支持了BE系列化合物是通過抑制2-E的通道活性來發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)以及抗病毒作用的觀點(diǎn)。綜合考慮體外活性、代謝性質(zhì)和毒性評價(jià)結(jié)果，研究團(tuán)隊(duì)選擇BE-33作為候選化合物，通過預(yù)防和治療給藥2種方式考察該化合物的體內(nèi)抗病毒作用。將BE-33以尾靜脈注射的方式給予人血管緊張素轉(zhuǎn)換酶-2（hACE-2）轉(zhuǎn)基因小鼠，分別在感染后的第1天及第3天，解剖小鼠并觀察小鼠器官的病理變化，期間采用qRT-PCR的方法檢測小鼠體內(nèi)SARS-CoV-2的復(fù)制情況。結(jié)果顯示，接受BE-33預(yù)防給藥/治療給藥的小鼠與對照組小鼠相比，其肺部病毒RNA水平在第1天和第3天均有下降的趨勢。此外，尸檢顯示對照組小鼠的下呼吸道出現(xiàn)不同程度的水腫、出血，提示其發(fā)生間質(zhì)性肺炎，而BE-33可以緩解這些癥狀。同時(shí)評估感染小鼠體內(nèi)炎癥，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BE-33組小鼠的炎癥細(xì)胞因子和趨化因子水平明顯低于感染小鼠。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，BE-33在預(yù)防給藥組以及治療給藥組均展現(xiàn)了良好的效果，尤其在治療給藥組中展現(xiàn)了優(yōu)良的抗病毒作用。文獻(xiàn)調(diào)研結(jié)果也顯示，這是為數(shù)不多的在動(dòng)物水平預(yù)防和治療性給藥均有效的化合物。
綜上所述，高召兵/沈敬山/李佳/張磊砢/鄭永唐聯(lián)合研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)并首次證明了新冠病毒包膜蛋白可形成離子通道，闡釋了其可能介導(dǎo)的生理和病理功能，并發(fā)現(xiàn)了在動(dòng)物水平兼具預(yù)防與治療SARS-CoV-2感染作用的小分子通道抑制劑。這項(xiàng)工作為抗新冠病毒藥物研發(fā)提供了潛在新靶點(diǎn)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了具有潛力的抗新冠病毒新藥候選化合物。該項(xiàng)研究工作還提示，以離子通道為靶點(diǎn)開展抗擊包括新冠病毒在內(nèi)的突發(fā)病毒感染藥物研發(fā)具有重要價(jià)值。
上海藥物所夏冰清副研究員、博士生申許瑞、何洋副研究員，以及武漢病毒所潘曉彥副研究員、昆明動(dòng)物所劉豐亮副研究員為該論文的共同第一作者。上海藥物所高召兵研究員、李佳研究員、沈敬山研究員，以及武漢病毒所張磊砢副研究員、昆明動(dòng)物所鄭永唐研究員為共同通訊作者。研究工作同時(shí)得到了上海藥物所蔣華良院士、周虎研究員、程曦副研究員以及武漢病毒所肖庚富研究員的支持和幫助。共同作者還包括該聯(lián)合研究團(tuán)隊(duì)其它成員。
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焦點(diǎn)事件
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項(xiàng)目成果
