Detect-seq技術為堿基編輯領域內(nèi)提供了CBE脫靶位點

2021.6.18

　　2021年6月8日，北大-清華生命科學聯(lián)合中心、北京大學生命科學學院伊成器教授課題組在Nature Methods雜志發(fā)表了題為“Detect-seq reveals out-of-protospacer editing and target-strand editing by cytosine base editors”的封面文章。研究人員在本研究工作的主要貢獻如下：

　　建立了一種無偏向性的脫靶檢測技術

　　作者通過捕獲胞嘧啶堿基編輯器CBE[1]產(chǎn)生的中間體（dU），并進行一系列標記和富集[2, 3]，獲得具有連續(xù)C-to-T突變的脫靶信號，并將其命名為Detect-seq（dU-detection enabled by C to T transition during sequencing）技術，該技術的主要技術路線如圖1所示。

　　圖1 Detect-seq技術路線圖

　　通過Detect-seq技術發(fā)現(xiàn)CBE工具導致的全基因組上的大量脫靶位點

　　研究人員在人胚腎細胞HEK293T和人乳腺癌細胞MCF-7轉染BE4max[4]，使用多種不同的sgRNA對基因組靶向位點進行C-to-T的編輯；同時對這些樣本中進行了Detect-seq檢測。通過Detect-seq檢測發(fā)現(xiàn)，除RNF2位點外，其它靶向位點均可以產(chǎn)生幾十至數(shù)百個Cas9依賴型的脫靶位點（圖2）。

　　圖2 在三種不同sgRNA樣品中鑒定到的Cas依賴型的脫靶位點，其中藍色圓圈代表脫靶位點（off-targets），紅色方塊代表靶向位點（on-target）EMX1n=48，VEGFA_site_2 n=511，HEK293_site_4 n=245

　　發(fā)現(xiàn)了兩種新型脫靶位點（out-of-protospacer edit和target-strand edit）

　　有趣的是，研究人員基于Detect-seq技術還發(fā)現(xiàn)了兩種新型的Cas依賴型的脫靶編輯：sgRNA結合區(qū)域外編輯（out-of-protospacer edit）及靶向鏈編輯（target-strand edit）（圖3）。sgRNA結合區(qū)域外編輯即C-to-T的編輯發(fā)生在sgRNA結合區(qū)域外；而靶向鏈編輯則是C-to-T編輯發(fā)生在sgRNA與DNA結合鏈。根據(jù)Detect-seq的結果，上述兩種編輯普遍存在于Cas9依賴型的脫靶位點附近。