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數(shù)字PCR簡(jiǎn)介

2021.6.29

1985年美國(guó)科學(xué)家Kary Mullis發(fā)明PCR方法以后，PCR已經(jīng)成為生命科學(xué)研究領(lǐng)域中最常規(guī)的實(shí)驗(yàn)方法之一。PCR是用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制。PCR的最大特點(diǎn)，是能將微量DNA大量擴(kuò)增。

最傳統(tǒng)的一代PCR采用瓊脂糖電泳的方式對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析，操作繁瑣、難于做定量分析。為使PCR技術(shù)能對(duì)基因水平進(jìn)行定量分析，1992年開(kāi)發(fā)了熒光實(shí)時(shí)定量PCR（二代PCR）。實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）通常在DNA擴(kuò)增時(shí)對(duì)反應(yīng)體系中的熒光信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)收集，通過(guò)三個(gè)參數(shù)間（熒光信號(hào)-Cq值（羅氏公司）或Ct值（ABI公司）-靶基因的起始濃度）的關(guān)系，能以相對(duì)定量的方式確定靶基因的拷貝數(shù)或推斷基因表達(dá)水平。由于熒光定量PCR的分析是相對(duì)定量的方式，這也是目前熒光定量PCR的最大技術(shù)缺點(diǎn)。在低拷貝靶分子、模板濃度差異的條件下，其檢測(cè)靈敏度、精確度都受到了限制。
1999年霍普金斯大學(xué)的Vogelstein教授首先提出了第三代的Digital PCR（數(shù)字PCR）的概念。此后數(shù)字PCR技術(shù)得到迅速的發(fā)展。數(shù)字PCR是一種核酸檢測(cè)和絕對(duì)定量的新方法。同傳統(tǒng)PCR相比，數(shù)字PCR增加了一步分隔(partitioning)的操作，將幾十微升的反應(yīng)體系分隔成了眾多微小獨(dú)立反應(yīng)體系。核酸模板在這種分割過(guò)程中被充分稀釋?zhuān)硐霠顟B(tài)下每個(gè)微反應(yīng)體系中至多含有1個(gè)分子的核酸模板。和qPCR不同，數(shù)字PCR不對(duì)擴(kuò)增過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，而是檢測(cè)end-point的熒光信號(hào)。擴(kuò)增完成后所有液滴的熒光將逐個(gè)被識(shí)別并進(jìn)行計(jì)數(shù)，不需要構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，就可以得到絕對(duì)定量的結(jié)果。
目前數(shù)字PCR的主要產(chǎn)品有：
1. QX200

?QX200目前已經(jīng)是Bio-Rad的產(chǎn)品。Bio-Rad的技術(shù)主要來(lái)源于QuantaLife公??司，QuantaLife 利用油包水微滴生成技術(shù)開(kāi)發(fā)了微滴式數(shù)字ddPCR，這是最早出現(xiàn)的相對(duì)成熟的數(shù)字PCR平臺(tái)，在運(yùn)行成本和實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定性方面都基本達(dá)到了商品化的標(biāo)準(zhǔn)。 2011年QuantaLife 公司被Bio-Rad公司收購(gòu)，其微滴式數(shù)字PCR儀產(chǎn)品更名為QX100，繼續(xù)在市場(chǎng)上銷(xiāo)售，2013年該公司又推出了升級(jí)型號(hào)QX200。
2. Raindrop

Raindrop數(shù)字PCR是美國(guó)RainDance Technologies公司于2012年推出的產(chǎn)品。能夠提供更高的檢測(cè)范圍，適用于處理更大濃度差異的不同樣品，這個(gè)設(shè)備將其原有的二代測(cè)序文庫(kù)制備平臺(tái)技術(shù)也整合進(jìn)入數(shù)字PCR技術(shù)平臺(tái)，在高壓氣體驅(qū)動(dòng)下，將每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系分割成100萬(wàn)至1000萬(wàn)個(gè)P升級(jí)微滴反應(yīng)乳液，這種超高的微滴數(shù)目可以為用戶(hù)“提供更高的檢測(cè)動(dòng)態(tài)范圍，適用于處理更大濃度差異的不同樣品。在2017年Bio-Rad完成了對(duì)RainDance公司的收購(gòu)。
3. Quant Studio 3D

Applied Biosystems 公司2013年也推出了Quant Studio 3D數(shù)字PCR系統(tǒng)，是目前數(shù)字PCR市場(chǎng)上新型號(hào)產(chǎn)品之一。采用高密度流控芯片技術(shù)，使樣本均勻分配至20,000個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)孔中。在整個(gè)測(cè)定流程中，樣本之間保持完全隔離，防止樣品交叉污染。移液過(guò)程和操作步驟減少。芯片式設(shè)計(jì)避免了微滴式系統(tǒng)可能出現(xiàn)的管路堵塞問(wèn)題。Applied Biosystems在OpenArray芯片平臺(tái)之外推出的全新的芯片式數(shù)字PCR系統(tǒng)，這個(gè)全新系統(tǒng)在設(shè)計(jì)上綜合考慮了系統(tǒng)穩(wěn)定性與運(yùn)行成本因素。 2013年Thermo Fisher公司收購(gòu)了Applied Biosystems。?
Quant Studio 3D 數(shù)字PCR可用于分子標(biāo)準(zhǔn)品定量；原體檢測(cè)和定量測(cè)定；罕見(jiàn)癌癥基因突變檢測(cè)；拷貝數(shù)變異分析；GMO檢測(cè)和污染評(píng)估；mRNA 和miRNA表達(dá)低倍變化的確定等。
4. Naica TM crystal

Naica? crystal數(shù)字PCR系統(tǒng)是由法國(guó)Stilla Technologies公司推出的產(chǎn)品。將微滴均勻性和芯片可視化以及相同PCR反應(yīng)條件創(chuàng)新性集成在同一系統(tǒng)中，使用微流體創(chuàng)新型Sapphire芯片，樣品通過(guò)毛細(xì)通道網(wǎng)格以30,000個(gè)Crystal微滴的形式進(jìn)入發(fā)布在2D芯片中。這種方法在滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)室對(duì)數(shù)據(jù)精準(zhǔn)性、重復(fù)性要求的同時(shí)，讓數(shù)字PCR分子檢測(cè)變得更加簡(jiǎn)單快捷。PCR擴(kuò)增過(guò)程在芯片上實(shí)現(xiàn)。最終對(duì)陽(yáng)性微滴計(jì)數(shù)從而得到精準(zhǔn)的核酸絕對(duì)數(shù)量。作為首款三個(gè)熒光通道檢測(cè)的數(shù)字PCR平臺(tái)，Naica? crystal數(shù)字PCR系統(tǒng)可在2小時(shí)內(nèi)實(shí)現(xiàn)多達(dá)36個(gè)目標(biāo)基因的檢測(cè)。Naica? Crystal系統(tǒng)由Geode微滴生成；擴(kuò)增儀和Prism3微滴閱讀分析系統(tǒng)組成，僅需唯一耗材——Sapphire芯片，即可完成從加樣、微滴生成和擴(kuò)增，直到采集數(shù)據(jù)獲得結(jié)果?！> Naica? crystal數(shù)字PCR可用于：基因表達(dá)差異檢測(cè)；拷貝數(shù)變異(CNV)；低豐度及稀有序列的精確定量；甲基化含量鑒定；腫瘤治療的伴隨診斷；無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查；病原微生物的檢測(cè)(病毒、細(xì)菌等)；二代測(cè)序輔助建庫(kù)；腫瘤治療的實(shí)時(shí)監(jiān)控 (ctDNA檢測(cè))等。

數(shù)字pcr

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