強(qiáng)大的基因組編輯工具-Crisp/cas9（二）
三、 產(chǎn)品推薦
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針對(duì)sgRNA和cas9，我們有如下產(chǎn)品可供選擇哦：
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1.sgRNA系列。
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（1）sgRNA載體類型
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| 貨號(hào) | 載體 | 啟動(dòng)子 | sgRNA | 是否含有Cas9核酸酶基因 | 篩選標(biāo)記/報(bào)告基因 |
| SG001 | pCRISPR-SG01 | U6 | 1 或多個(gè) | 無(wú)，Cas9克隆單獨(dú)出售 | Hygromycin |
| SG002 | pCRISPR-LvSG03 | U6 | 1 或多個(gè) | 無(wú)，Cas9克隆單獨(dú)出售 | Puromycin / mCherry |
| SG012 | pCRISPR-CG02 | U6 | 1 | 有，載體含有CBh啟動(dòng)子啟動(dòng)表達(dá)的Cas9核酸酶基因 | N/A |
| SG013 | pCRISPR-CG04 | U6 | 1或多個(gè) | 有，載體含有CMV啟動(dòng)子啟動(dòng)表達(dá)的Cas9核酸酶基因 | Neomycin / copGFP |
| SG014 | pCRISPR-CG07 | U6 | 1 | 有，載體含有CBh啟動(dòng)子啟動(dòng)表達(dá)的Cas9核酸酶基因 | copGFP |
| SG015 | pCRISPR-CG08 | U6 | 1 | 有，載體含有CBh啟動(dòng)子啟動(dòng)表達(dá)的Cas9核酸酶基因 | mCherry |
| — | pCRISPR-CG12 | U6 | 1或多個(gè) | 有，載體含有CMV啟動(dòng)子啟動(dòng)表達(dá)的Cas9核酸酶基因 | Neomycin / mCherry |
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*配合單獨(dú)表達(dá)Cas9 核酸酶(Cat.No.? CP-C9NU-01,? CP-LvC9NU-01, CP-LvC9NU-02, CP-LvC9NU-08,? CP-LvC9NU-09,? CP-LvC9NU-10)或 Cas9 D10A切口酶(Cat.No.CP-C9NI-01,? CP-C9NI-02) 的 Cas9克隆使用。
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還有有上述貨號(hào)對(duì)應(yīng)搭配使用的sgRNA亂序?qū)φ张?/p>
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| 貨號(hào) | 產(chǎn)品 | 篩選標(biāo)記 | 報(bào)告基因 |
| CCPCTR01-CG02 | Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG02. | Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG02. | N/A |
| CCPCTR01-CG04 | Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG04 | Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG04 | |
| CCPCTR01-CG07 | Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG07 | Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG07 | |
| CCPCTR01-CG08 | Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG08 | Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG08 with mCherry | |
| CCPCTR01-LvSG03 | Scrambled sgRNA control for pCRISPR-LvSG03 | Scrambled sgRNA control for pCRISPR-LvSG03 | mCherry |
| CCPCTR01-SG01 | Scrambled sgRNA control for pCRISPR-SG01 | Scrambled sgRNA control for pCRISPR-SG01 | N/A |
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（2）還有sgRNA亂序?qū)φ章《绢w粒
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| 貨號(hào) | 產(chǎn)品 | 描述 | 啟動(dòng)子 | 篩選標(biāo)記 | sgRNA |
| LPP-CCPCTR01-LvSG03-100 | sgRNA 對(duì)照 CCPCTR01-LvSG03 的純化慢病毒顆粒（25 μL×4管） | 108?TU/ml sgRNA 對(duì)照 CCPCTR01-LvSG03 的純化慢病毒顆，轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí) | EF1a | Puromycin | CCPCTR01-LvSG03 |
| LPP-CCPCTR01-LvSG03-400 | sgRNA 對(duì)照 CCPCTR01-LvSG03 的純化慢病毒顆粒（100μL，25 μL×16管） | 108?TU/ml sgRNA 對(duì)照 CCPCTR01-LvSG03 的純化慢病毒顆，轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí) | EF1a | Puromycin | CCPCTR01-LvSG03 |
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圖3. HUWEI-sgRNA/Cas9靶向HEK293T細(xì)胞中的HUWEI基因。（A）HUWEI-sgRNA與基因組PCR引物設(shè)計(jì)；（B）在6孔板中，HUWEI-sgRNA/Cas9克隆與sgRNA/Cas9對(duì)照克?。ㄓ镜?）轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染40h后收集細(xì)胞，提取基因組DNA并用HUWE特異的PCR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，凝膠純化PCR產(chǎn)物，將純化后的產(chǎn)物與緩沖液混勻，經(jīng)變性、退火后在37℃水浴下T7 ENI剪切60min。HUWEI經(jīng)PCR后的產(chǎn)物片段長(zhǎng)度應(yīng)為520bp，T7 ENI剪切后的產(chǎn)物應(yīng)分別為330bp和190bp。
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圖4. CRISPR-Cas9多重靶向編輯多個(gè)基因。實(shí)驗(yàn)組（1-4泳道）為Cas9表達(dá)克隆及分別表達(dá)靶向p53, HUWE1, NCL3 和
GFP基因的sgRNA克隆質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293t
GFP穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞。對(duì)照組（5-8泳道）為Cas9表達(dá)克隆質(zhì)及隨機(jī)sgRNA表達(dá)克隆的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293t
GFP穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞。通過(guò)T7核酸內(nèi)切酶檢測(cè)分析基因組DNA各個(gè)靶點(diǎn)上同時(shí)存在的插入缺失。*號(hào)標(biāo)記的條帶顯示Cas9核酸酶及分別靶向多個(gè)靶點(diǎn)的sgRNA都在目標(biāo)靶點(diǎn)上有效地誘發(fā)了插入缺失突變（1-4道）。PCR產(chǎn)物條帶及T7核酸內(nèi)切酶酶切產(chǎn)物條帶大小：GFP:
720bp (完整), 340bp + 380bp (酶切); NCL3: 765bp (完整), 295bp +470bp (酶切);
HUWE: 520bp (完整), 190bp + 330bp (酶切); P53: 825bp (完整), 475bp + 350bp
(酶切).
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（3）sgRNA 文庫(kù)
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圖5. A：混合文庫(kù)篩選。對(duì)感染了sgRNA混合文庫(kù)的細(xì)胞株進(jìn)行篩選，獲取具備目的表型的陽(yáng)性細(xì)胞株進(jìn)行Sanger測(cè)序識(shí)別對(duì)應(yīng)的sgRNA，或通過(guò)深度測(cè)序搜索比例過(guò)高或過(guò)低的sgRNA。B：使用 sgRNAs 文庫(kù)array（獨(dú)立克隆文庫(kù)）進(jìn)行基因敲除篩選。各板孔里的細(xì)胞株分別感染不同的sgRNA慢病毒顆粒，并篩選具備目的表型的陽(yáng)性細(xì)胞株。如此無(wú)需測(cè)序即可獲知與目的表型相關(guān)的sgRNA。
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