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核酸提取純化及濃縮方法應該選______
自20世紀誕生以來，分子生物學迅速發(fā)展并在整個生命科學領域廣泛滲透和應用，推動了傳統(tǒng)醫(yī)學進入基于分子層面實驗科學的現(xiàn)代生物醫(yī)學時代。
核酸提取和純化是分子生物學試驗的基礎，在以下應用實驗中都需要進行核酸提?。?/span>
●?分析基礎研究和疾病研究中的基因表達；
● 跟蹤對藥物治療的反應(例如，在抗病毒治療期間和之后監(jiān)測病毒滴度）；
● 識別新物種并深入了解進化過程 (例如，Ancient DNA分析）；
● 對人類、動物和植物中引起傳染病暴發(fā)的病原體進行監(jiān)測和分類；
● 通過微生物檢測和量化監(jiān)測食品和水安全；
● 診斷疾病 (如基因疾病，癌癥，免疫學缺陷）。
核酸提取純化基本步驟
核酸純化方法是影響提取核酸質(zhì)量高低的最重要因素之一，也是下游分子生物學試驗成敗的關(guān)鍵，遵循提取純化原則以及選擇合適的純化、濃縮方法，可以使核酸的質(zhì)量及回收率達到最大化。
核酸提取純化原則和要求
● 需要保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性，為下游實驗做準備；
● 排除其它核酸分子的污染（提取DNA時排除RNA的干擾，反之亦然）；
● 核酸樣品中沒有對酶有抑制作用的有機溶劑和高濃度的金屬離子；
● 將核酸樣品中其它生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子的污染降到最低程度。
核酸提取純化的常見方法
溶液抽提法
經(jīng)典的DNA提取方法：酚氯仿抽法，主要是使用兩種不同的有機溶劑交替抽提將蛋白去除。通過苯酚氯仿處理細胞破碎液或者組織勻漿后，在水相中主要溶解的是以DNA為主的核酸成分，在有機相中主要是多糖和脂類物質(zhì)，蛋白質(zhì)則沉淀于兩相之間。離心分層后取出水層，多次重復操作，再合并含核酸的水相，利用核酸不溶于醇的性質(zhì)，用乙醇沉淀核酸，之后再離心分離和溶解洗脫，最后通過將洗滌后的核酸沉淀進行濃縮干燥即可得到高純度核酸。
離心柱法（柱膜法）
通過特殊硅基質(zhì)吸附材料，能夠特定吸附DNA，而RNA和蛋白質(zhì)順利通過。硅膠膜表面的硅醇基團呈弱酸性，其水化后帶負電。當溶液中存在一定濃度的陽離子后，形成的陽離子橋能夠中和DNA和硅醇基團之間的表面負電荷，從而使DNA牢固地吸附在硅膠膜表面。反之，處于低鹽水溶液狀態(tài)下時，由于硅膠膜的硅醇基團與DNA磷酸基團之間的靜電排斥，硅膠膜釋放DNA。
利用高鹽低PH結(jié)合核酸，低鹽高PH值洗脫，來分離純化核酸。離心柱純化也是試劑盒提取中廣泛的使用方法。
磁珠法
運用納米技術(shù)對超順磁性納米顆粒的表面進行改良和表面修飾后，該磁珠能在微觀界面上與核酸分子特異性地識別和高效結(jié)合。磁珠法利用了磁性顆粒活性基團在一定條件下可與核酸結(jié)合和解離的原理，先使用細胞裂解液裂解細胞，帶有活性基團的磁性顆?？商禺愋晕綇募毎杏坞x出來的核酸分子，而樣品中的其他干擾物則很好的移除了，在磁場作用下，磁性顆粒與液體分開完成，最后回收顆粒（即磁珠-DNA 混合物），再用洗脫液洗脫，純化濃縮后即可得到純凈的DNA，獲得質(zhì)量較高的核酸模板。
提取純化方法的選擇
一般地，分離純化步驟越多，核酸的純度也越高，但得率會逐漸下降，完整性也愈難以保證。相反，通過分離純化步驟少的實驗方案，我們可以得到比較多的完整性較好的核酸分子，但純度不一定很高。這需要結(jié)合核酸的用途而加以選擇。
如果對核酸提取的質(zhì)量要求不高，可以選擇經(jīng)濟實惠的溶液法，選擇柱膜法還是磁珠法自動化提取，基本上取決于樣本數(shù)量，針對大批量的樣本，優(yōu)選磁珠法自動化提取。如果對樣本數(shù)量較少，則可以選擇柱膜法，既快速又經(jīng)濟實用。對于Oligo寡核苷酸的純化，實驗要求更高。（可參考往期推文）
不管采用哪一種核酸提取純化方法最后都離不開濃縮干燥！
●?再濃縮核酸樣品，隨著核酸提取試劑的逐步加入，以及去除污染物過程中核酸分子不可避免的丟失，樣品中核酸的濃度會逐漸下降，甚至影響到后面的實驗操作或不能滿足后繼研究與應用的需要時，需要對核酸進行濃縮，可將150uL DNA水溶液濃縮至10uL再進行測序；
●?去除DNA樣品中醇的殘留，當DNA樣品中有乙醇的殘留會影響測序反應；
●?干燥DNA樣品。DNA沉淀后可能會含水或水/乙醇混合液，濃縮去除后可以得到干燥的DNA樣品。
常用的干燥方法：風干VS真空離心濃縮儀應用案例分享
WTCHG（牛津大學人類遺傳學威康信托中心) 使用Sequenom MassARRAY?SNP 基因分型系統(tǒng)用于SNP分析，樣品前制備過程分別使用風干（左）和Genevac EZ-2真空離心濃縮儀（右）干燥含有寡核苷酸樣品的384孔板。
下圖結(jié)果表明，使用EZ-2真空離心濃縮儀干燥寡核苷酸樣品，可以大大降低樣品降解率，保證樣品不會被污染，消除了樣品損壞的潛在來源。
深綠色-高樣本數(shù)據(jù)質(zhì)量
淺綠色-中等樣本數(shù)據(jù)質(zhì)量
紅色-樣品質(zhì)量差或無數(shù)據(jù)
使用真空離心濃縮儀，可以避免核酸濃縮干燥遇到的過度加熱、絕對干燥、交叉污染及紫外損害保證核酸樣品的完整性。
Genevac真空離心濃縮儀
濃縮干燥DNA樣本，Genevac真空離心濃縮儀是合適的選擇，Genevac系統(tǒng)廣泛應用于DNA樣品制備與純化處理，不論是處理PCR前的簡單的小體積濃度DNA pellets，還是高通量處理許多純化DNA或寡核苷酸的樣品，都有不同的機型可供選擇。
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Genevac
英國Genevac是德祥集團資深合作伙伴之一。英國Genevac公司成立于1990年，隸屬SP Scientific旗下，一直專注于研究和生產(chǎn)各種離心蒸發(fā)濃縮設備，其產(chǎn)品廣泛應用于生命科學、制藥、化學、分析等領域。
德祥科技
德祥科技有限公司成立于1992年，總部位于中國香港特別行政區(qū)，分別在越南、廣州、上海、北京設立分公司。主要服務于大中華區(qū)和亞太地區(qū)——在亞太地區(qū)有27個辦事處和銷售網(wǎng)點，5個維修中心和2個樣機實驗室。
30多年來，德祥一直深耕于科學儀器行業(yè)，主營產(chǎn)品有實驗室分析儀器、工業(yè)檢測儀器及過程控制設備，致力于為新老客戶提供更完善的解決方案。公司業(yè)務包含儀器代理，維修售后，實驗室咨詢與規(guī)劃，CRO凍干工藝開發(fā)服務以及自主產(chǎn)品研發(fā)、生產(chǎn)、銷售、售后。與高校、科研院所、政府機構(gòu)、檢驗機構(gòu)及知名企業(yè)保持密切合作，服務客戶覆蓋制藥、醫(yī)療、商業(yè)實驗室、工業(yè)、環(huán)保、石化、食品飲料和電子等各個行業(yè)及領域。
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