應用定量PCR技術，用一種標準作對照能夠估計出一種特異性靶DNA或RNA分子的相對含量。 參照物： 在定量PCR 中必須加入?yún)⒄瘴?，用來作為擴增系統(tǒng)的陽性對照，并作為未知樣本定量的標準，且通過競爭性作用校正擴增系統(tǒng)內(nèi)管間的擴增效率，使其具有可比性。參照物按其性質(zhì)不同可分為內(nèi)參照和外參照。 內(nèi)參照和外參照均是在定量PCR 過程中一種含量已知的標準品模板。根據(jù)參照物的不同，定量PCR分為競爭性定量PCR和非競爭性定量PCR。內(nèi)參照是與待檢樣本加于同一反應管中，與樣本共用或不共用同一對引物的標準模板。共用同一對引物者，兩個模板的擴增存在競爭性，稱競爭性內(nèi)參照，這種條件下進行的定量PCR屬競爭性定量PCR；相反，不共用同一對引物時則不存在競爭性，為非競爭性內(nèi)參照，屬非競爭性定量PCR。 外參照則是參照物與待檢樣本的擴增分別在不同的管間進行。采用外參照進行的定量PCR屬非競爭性定量PCR。 非競爭性對照基因定量法： 即是靶基因與參照基因的同步擴增。是在同樣的反應條件下，在一個試管內(nèi)同步擴增來自同一DNA 的一段靶序列和另一段內(nèi)標序列(通常是管家基因或它們的mRNA)。此內(nèi)標序列可控制DNA的量、可擴增性和管間擴增效率的變化。通過比較兩種序列的擴增產(chǎn)物電泳帶的顏色強度對靶基因定量。此法只有在靶序列和作為對照的內(nèi)標序列的含量及擴增效率相似時才能得到準確的定量結果。這種擴增效率的差異常發(fā)生在PCR 的終末期，所以最好定量處于擴增指數(shù)期的PCR 產(chǎn)物。擴增后可通過測量電泳帶的相對強度而定量。只有當靶序列和內(nèi)標序列以相同的量存在時，才能對兩者進行相對定量。 競爭性PCR： 競爭PCR 與前述方法相似，即靶基因與參考標準在同一反應管中共同擴增，但參照標準通常是一段人工合成的模板而不是內(nèi)源性基因。競爭PCR 必須構建一個內(nèi)部標準，此標準能與靶基因競爭聚合酶、核苷酸和引物分子，具有相同的引物結合位點，其擴增產(chǎn)物能通過電泳或高效液相色譜(HPLC)等方法區(qū)分開來。對競爭性模板作系列稀釋后加入到恒量的樣品DNA中進行PCR，靶基因的量取決于所添加的競爭性DNA片段的量，使兩者的PCR終產(chǎn)物有相等摩爾數(shù)。競爭PCR 有效地控制了不同反應管間擴增效率的差異。若反應條件達到要求，可不必使反應限制于指數(shù)擴增期，靶序列可在較大范圍內(nèi)獲得定量并能檢測到其2 倍的差別。因此,競爭性PCR 是應用最廣的定量PCR 方法。通過競爭性PCR 進行絕對定量的條件是靶序列和競爭序列的擴增效率相同、引物相同，靶基因和競爭基因的初始比值在整個反應過程中保持不變。

二．材料與方法 1．使用外參照的半定量PCR 1） 肝臟總RNA的提取與定量 (1) 肝臟總RNA的提取按第二部分實驗一進行。 (2) 肝臟總RNA的定量 將提取的總RNA稀釋一定的倍數(shù)后，用紫外分光光度計測定260nm和280nm兩個波長處的光吸收值，然后按以下公式來計算提取得到的總RNA的濃度：[RNA濃度]=A 260 ×40×稀釋倍數(shù) μg/ml 260nm和280nm 兩處讀數(shù)的比值（A 260 /A 280 ），可反映核酸的純度。DNA 和RNA 純品的A 260 /A 280 的值分別為1.8 和2.0 如果樣品中有蛋白質(zhì)或酚的污染，則A 260 /A 280 將明顯低于此值，此時就無法對樣品中的核酸進行精確定量。 獲得總RNA濃度后，用RNase-Free Water 將總RNA濃度調(diào)整為1μg/μl。