（一）、 儀器 設(shè)備 英國Thermo Hybaid原位PCR儀。 （二）、操作流程 1、原位PCR步驟 1）預(yù)處理： （1）切片常規(guī)脫蠟； （2）0.2mol/L HCl處理10min； （3）5μg/ml蛋白酶K消化組織37℃10min； （4）Nase消化組織37℃ 30min； （5）梯度酒精脫水，室溫干燥。 2）原位擴增： （1）切片滴加特異性序列引物30μLPCR擴增反應(yīng)液，覆蓋硅化蓋玻片，石蠟油封邊； （2）PCR熱循環(huán)：94℃，1min；55℃，1min；72℃，1.5min，共25～30個循環(huán)，72℃延伸10min； （3）氯仿洗去蓋玻片，4％多聚甲醛后固定10min，梯度酒精脫水，干燥。 3) 原位雜交： （1）加地高辛標記探針的雜交液，98℃變性10min，-20℃退火5min，42℃雜交過夜。 （2）雜交后用2×SSC洗滌10min，3次，1×SSC洗滌10min，3次； （3）緩沖液洗滌10min，3次； （4）加堿性磷酸酶標記的羊抗地高辛抗體復(fù)合物，37℃，2h； （5）緩沖液洗滌5min，3次； （6）NBT、BCIP暗處顯色，鏡下控制，終止顯色。 （7）常規(guī)脫水：透明、封固。 2、原位RT-PCR步驟 1）預(yù)處理： （1）蛋白酶K(0.3mg/mL) 54℃消化20min，蒸餾水洗； （2）95℃加熱3min，滅活殘存的蛋白酶。 2）原位擴增： （1）在有RNA酶抑制劑存在的條件下，用隨機六聚物進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)； （2）用熱啟動法進行PCR擴增。標本加熱至75℃時加上反應(yīng)液，覆以蓋玻片，四周用指甲油密封。然后將溫度升至95℃，2min。再將熱循環(huán)儀設(shè)定為95℃，45s，55℃，1min和75℃，45s，共26次循環(huán)； （3）擴增結(jié)束后，在80℃烤15min～30min。 3）原位雜交： （1）雜交前標本95℃加熱3min； （2）加上雜交液，濕盒內(nèi)50℃過夜；雜交液組成：25％硫酸葡聚糖，2×SSC，50％甲酰胺，0.33mg/ml變性的鮭魚精子DNA， 每0．5mL雜交液內(nèi)含生物素標記探針1ng。 （3）擴增的β-肌動蛋白和IL-6用DAKO檢測 試劑 盒K600(鏈霉卵白素， 生物 素標記的堿性 磷酸酶 和硝基四氮唑藍)檢測。陽性反應(yīng)呈紫色。