碧云天生產(chǎn)的超級(jí)感受態(tài)細(xì)菌制備試劑盒(Supercompetent Cell Preparation Kit)是一種用于快速制備高轉(zhuǎn)化效率大腸桿菌 感受態(tài)細(xì)菌的試劑盒。超級(jí)感受態(tài)細(xì)菌制備試劑盒是在傳統(tǒng)超級(jí)感受態(tài)細(xì)菌制備方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行適當(dāng)改良而成，操作便捷，轉(zhuǎn)化效率高。

使用本試劑盒可以使感受態(tài)效率達(dá)到108-109 cfu/μg質(zhì)粒。對(duì)于小的質(zhì)粒效率略高，而對(duì)于大的質(zhì)粒則效率略低一些。用本試 劑盒制備的超級(jí)感受態(tài)細(xì)菌不僅可以轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，而且非常適合于轉(zhuǎn)化普通的連接產(chǎn)物，特別適合于轉(zhuǎn)化平端連接等需要高轉(zhuǎn)化效 率的情況 。

使用本試劑盒操作簡(jiǎn)單，細(xì)菌培養(yǎng)好后僅需60分鐘左右即可完成超級(jí)感受態(tài)細(xì)菌的制備。

本試劑盒適用于絕大部分常見的大腸桿菌，包括DH5α、JM109、TG1、HB101和XL-1等。對(duì)于一些用于蛋白表達(dá)或病毒質(zhì)粒構(gòu)建 的特殊大腸桿菌也適用，制備出來的感受態(tài)菌轉(zhuǎn)化質(zhì)?？隙]有問題，但如果轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物有時(shí)效果不如DH5α等其它常見的細(xì) 菌。

本試劑盒提供了專門用于制備超級(jí)感受態(tài)的特殊細(xì)菌培養(yǎng)液，可以提高制備出來的感受態(tài)菌的轉(zhuǎn)化效率，同時(shí)也方便了用戶，不 必自行配置相應(yīng)的培養(yǎng)液。

本試劑盒可以分多次使用，共可以制備足夠進(jìn)行100次轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)菌。

保存條件：

-20℃保存，一年有效。

注意事項(xiàng)：

在制備感受態(tài)細(xì)菌的過程中均使用不含抗生素的LB。在使用感受態(tài)菌的過程中熱休克后的37℃培養(yǎng)時(shí)也必須使用無抗生素的LB， 即便轉(zhuǎn)入的質(zhì)粒是有抗性的。

為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

使用說明：

1. 涂平板： 為取得最佳的感受態(tài)效率，必須先把甘油菌或其它形式保存的菌種涂LB平板，并培養(yǎng)過夜。

2. 接種： 取一有新鮮培養(yǎng)的菌種的LB平板，后續(xù)操作均在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。把鑷子的頂端在70%酒精中蘸一下，并在酒精燈上略略燒一下， 使鑷子的頂端處于無菌狀態(tài)。用鑷子夾取一個(gè)無菌的塑料槍頭或牙簽，從平板上挑取一個(gè)單克隆，然后把蘸有菌種的塑料槍頭或 牙簽放到裝有3毫升LB的細(xì)菌培養(yǎng)試管內(nèi)。上述操作也可以使用接種環(huán)等進(jìn)行操作。

3. 培養(yǎng)： 37℃約200rpm培養(yǎng)過夜，通常培養(yǎng)時(shí)間控制在16小時(shí)左右為宜。絕對(duì)不宜超過18小時(shí)。

4. 再接種培養(yǎng)： 根據(jù)需要制備的超級(jí)感受態(tài)細(xì)菌的量，按照1:500的比例用新鮮培養(yǎng)的過夜菌接種培養(yǎng)。例如取100微升的新鮮過夜菌到50毫升本 試劑盒提供的超級(jí)感受態(tài)細(xì)菌培養(yǎng)液中，37℃約200rpm培養(yǎng)。通常在大約培養(yǎng)2.5-3.5小時(shí)后OD600可以達(dá)到0.6-0.7。

5. 制備感受態(tài)細(xì)菌：

(1) 在培養(yǎng)的細(xì)菌OD600達(dá)到0.6-0.7時(shí)，把培養(yǎng)的菌液置于冰浴中，冷卻15分鐘。注意：后續(xù)所有操作均須在4度或冰浴進(jìn)行。

(2) 4℃ 4000g離心5分鐘收集細(xì)菌，棄上清。 注意：離心機(jī)必須預(yù)先冷卻。

(3) 如果離心沉淀前的菌量為50毫升，按后續(xù)操作進(jìn)行，如果是其它體積則按比例換算后進(jìn)行后續(xù)操作。

(4) 用20毫升預(yù)冷的超級(jí)感受態(tài)制備試劑A輕輕重懸細(xì)菌沉淀。懸浮時(shí)一定要很輕很慢，否則會(huì)影響效果。

(5) 冰浴15分鐘。

(6) 4℃ 4000g離心5分鐘收集細(xì)菌，棄上清。 注意：離心機(jī)必須預(yù)先冷卻。

(7) 用2毫升預(yù)冷的超級(jí)感受態(tài)制備試劑B輕輕重懸細(xì)菌沉淀。懸浮時(shí)一定要很輕很慢，否則會(huì)影響效果。

(8) 冰浴15分鐘。

(9) 在冰浴上進(jìn)行分裝，可以根據(jù)需要適當(dāng)分裝成50-200微升/管。

(10) 立即使用或用液氮或乙醇干冰浴速凍后-70℃保存。通常6個(gè)月內(nèi)效率不會(huì)有明顯的變化。

6. 感受態(tài)細(xì)菌的使用：

(1) 對(duì)于感受態(tài)細(xì)菌效率的測(cè)定或連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化(其它如基因突變產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化等參考連接產(chǎn)物進(jìn)行) ：

a) 在冰上緩慢融解感受態(tài)細(xì)菌(對(duì)于新鮮制備的感受態(tài)就可以直接使用了)，如果檢測(cè)感受態(tài)細(xì)菌的效率，加入10pg-1ng質(zhì) 粒，但質(zhì)粒的體積不宜超過感受態(tài)細(xì)菌量的10%。如果轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物，每50微升感受態(tài)細(xì)菌加入2-10微升連接產(chǎn)物。

b) 輕輕用手指彈動(dòng)離心管，以混勻細(xì)菌和質(zhì)?；蜻B接產(chǎn)物。冰浴或冰水浴放置30分鐘。

c) 42℃水浴，熱休克2分鐘。

d) 熱休克后立即置于冰水浴中，2分鐘。

e) 加入900微升LB，37℃200rpm培養(yǎng)1小時(shí)。

f) 如果檢測(cè)感受態(tài)效率，取100微升涂布到含有相應(yīng)抗生素的LB平板上。如果轉(zhuǎn)化的是連接產(chǎn)物，2000-3000g離心1分鐘或更 長(zhǎng)時(shí)間使細(xì)菌充分沉淀下來。去除約900-950微升LB培養(yǎng)液。細(xì)菌沉淀用余下的LB培養(yǎng)液重懸，然后全部涂布到含有適當(dāng)抗生素的LB平板上。37℃培養(yǎng)過夜。

(2) 對(duì)于質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化：

a) 融解感受態(tài)細(xì)菌，加入不少于50ng質(zhì)粒到30-50微升感受態(tài)細(xì)菌中。質(zhì)粒的量可以是1微克或更多，但體積不宜超過感受態(tài) 細(xì)菌量的10%。

b) 輕輕用手指彈動(dòng)離心管，以混勻細(xì)菌和質(zhì)粒。冰浴或冰水浴放置10分鐘。

c) 取全部菌液直接涂布到含有適當(dāng)抗生素的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜。