摘要： 本實(shí)驗(yàn)介紹了細(xì)菌的轉(zhuǎn)化與平板篩選的原理及操作步驟。

實(shí)驗(yàn)原理

感受態(tài)是指 細(xì)菌 處于容易吸收外源 DNA 的狀態(tài)。轉(zhuǎn)化是指質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)人細(xì)菌的過程。其原理是細(xì)菌處于0℃，CaCl 2 低滲溶液中，菌細(xì)胞膨脹成球形。

轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羥基―鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)42℃短時(shí)間熱擊處理，促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物。將細(xì)菌放置在非選擇性培養(yǎng)基中保溫一段時(shí)間，促使在轉(zhuǎn)化過程中獲得的新的表型(如Ampr等)得到表達(dá)，然后將此細(xì)菌培養(yǎng)物涂在含有氨芐青霉素的選擇性培養(yǎng)基上。

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞后，還需對轉(zhuǎn)化菌落進(jìn)行篩選鑒定。利用α互補(bǔ)現(xiàn)象進(jìn)行篩選是最常用的一種鑒定方法?，F(xiàn)在使用的許多載體都具有一段 大腸桿菌 β半乳糖苷酶的 啟動(dòng)子 及其編碼α肽鏈的DNA序列，此結(jié)構(gòu)稱為lacZ'基因。

lacZ'基因編碼的α肽鏈?zhǔn)铅掳肴樘擒彰傅陌被说亩唐?146個(gè) 氨基酸 )。任何攜帶著lacZ'基因的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化了染色體 基因組 存在著此種β半乳糖苷酶 突變的大腸桿菌細(xì)胞后，便會(huì)產(chǎn)生出有功能活性的半乳糖苷酶，在IPTG(異丙基β-D-硫代半乳糖苷)誘導(dǎo)后。

在含有Xgal(5-溴-4-氯-3-吲哚-6-D-半乳糖苷)的培養(yǎng)基平板上形成藍(lán)色菌落（半乳糖苷酶能將無色的化合物Xgal切割成半乳糖和深藍(lán)色的底物5-溴-4-靛藍(lán)）。

而當(dāng)有外源DNA片段插入到位于lacZ'中的多克隆位點(diǎn)后，就會(huì)破壞α肽鏈的閱讀框，從而不能合成與受體菌內(nèi)突變的β半乳糖苷酶相互補(bǔ)的活性α肽，而導(dǎo)致不能形成有功能活性的β半乳糖苷酶，也就不能分解Xgal而顯藍(lán)色，因此含有重組質(zhì)粒載體的克隆往往是白色菌落。

主要試劑

1. 0.1mol／L CaCl 2 溶液

2. LB液體培養(yǎng)基及LB固體培養(yǎng)基

3. 氨芐青霉素(Amp)：用無菌水配制成100mg／mL溶液，置-20℃冰箱保存。

4. Xgal：將Xgal溶于二甲基甲酰胺，配成20mg／mL，不需過濾滅菌，分裝小包裝，避光貯存于-20℃。

5. IPTG：取2g IPTG溶于8mL雙蒸水中，再用雙蒸水補(bǔ)至10mL，用0.22um濾膜過濾除菌，每份1mL，貯存于-20℃。

主要設(shè)備

1. 超凈工作臺(tái)

2. 低溫離心機(jī)

3. 恒溫?fù)u床

4. 恒溫箱

5. 恒溫水浴

6. 離心管

7. 試管

8. 培養(yǎng)皿

9. 錐形瓶

10. 接種針

11. 玻璃涂棒

12. 酒精燈

13. 鑷子及牙簽

實(shí)驗(yàn)材料

1. 大腸桿菌DH5α

2. 質(zhì)粒

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 制備感受態(tài)細(xì)胞

1) 吸取15μl E.coil菌液，接種于20ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，待OD 600 =0.5左右將該菌懸液以1：50接種量轉(zhuǎn)于50ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液開始出現(xiàn)混濁后，每隔20-30min測一次OD 600 ，至OD 600 =0.6左右，停止培養(yǎng)。

2) 培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入離心管中，在冰浴10min，4℃下5000rpm離心10min。

3) 棄上清液，用4ml冰預(yù)冷的0.1M CaCl 2 溶液輕輕懸浮菌體至均勻，冰上放置30min

4) 4℃下5000rpm離心6min。

5) 棄上清液，用2ml冰預(yù)冷的0.1M CaCl 2 溶液輕輕懸浮菌體至均勻，冰上放置片刻后即制成感受態(tài)細(xì)胞懸液。

6) 以上制好的感受態(tài)細(xì)胞懸液可在冰上放置，24小時(shí)內(nèi)直接用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，也可加入15%高壓滅菌過的甘油，混勻后，分裝于1.5ml離心管中，每管100μ l感受態(tài)細(xì)胞懸液，置-70℃條件下保存。.

2. 質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌

1) 取100μl搖勻后的感受態(tài)細(xì)胞懸浮液（如是冷凍保存液，則需化凍后馬上進(jìn)行下面的操作），加入5μl連接產(chǎn)物，輕輕搖勻，冰上放置30min后，于42 IPTG水浴中保溫90s，然后迅速在冰上冷卻2min。

2) 加入900μl LB液體培養(yǎng)基，則總體積約1ml，混勻于37℃振蕩培養(yǎng)90分鐘使受體菌恢復(fù)正常生長狀態(tài)并使轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生抗藥性Ampr。

3) 在預(yù)制的LB瓊脂平板上，加40uL 20mg／mL的Xgal和4uL 200mg／mL的IPTG溶液，并用滅菌玻璃推子(酒精燈上燒后冷卻)，均勻涂布于瓊脂凝膠表面，37℃倒置吸收。

4) 將恢復(fù)培養(yǎng)的菌體4000rpm離心5min，移去上層900μl LB培養(yǎng)基，用余下的100μl重懸菌體至均勻。

3. α互補(bǔ)現(xiàn)象的檢查

將重懸菌體均勻涂布于含X-gal加IPTG加氨芐青霉素的LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-24h，出現(xiàn)菌落。其中白色菌落從理論上講為重組克隆。

如果進(jìn)一步驗(yàn)證，可挑取多個(gè)白色菌落分別接種到1ml含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)6-8h，然后提取質(zhì)粒酶切驗(yàn)證，或進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增鑒定。

注意事項(xiàng)

1. 細(xì)菌生長狀態(tài)和密度：不要用經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接和貯存于-4℃的培養(yǎng)菌，最好從-70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。細(xì)菌生長密度則以剛進(jìn)入生長對數(shù)期為好。

2. 防止雜菌和雜DNA的污染：整個(gè)操作過程均應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行。