PriCells: AUTOMACS 系統(tǒng)自動(dòng)分選體系分選 小鼠CD4+ CD25+ 抑制性細(xì)胞

實(shí)驗(yàn)材料：

1. 小鼠

2. HBSS洗滌緩沖液

3. MACS緩沖液

4. CD8a（Ly-2）磁珠

5. 結(jié)合緩沖液

6. biotin-抗CD25（7D4）

7. Streptavidin-PE

8. 抗PE磁珠

9. 完全RPMI培養(yǎng)基

10. 小鼠CD3+ T細(xì)胞富集柱和1×純化柱緩沖液

11. 15ml離心管，無菌

12. autoMACS系統(tǒng)和分選柱

13. 30mm尼龍網(wǎng)或40mm預(yù)分離濾膜

實(shí)驗(yàn)方法：

1. 用20只小鼠的淋巴結(jié)制備單細(xì)胞懸液并去除紅細(xì)胞。

2. 將細(xì)胞在20mlHBSS洗滌緩沖液中混懸后用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。

3. 將細(xì)胞懸液在4℃，200g離心10min。離心過程中，準(zhǔn)備3支小鼠CD3+ T細(xì)胞純化柱，按說明書的指導(dǎo)用1×純化柱緩沖液洗3遍。棄洗脫液，在每支純化柱下方放置一支15ml離心管。

4. 用3ml 1×純化柱緩沖液和3ml HBSS洗滌緩沖液混懸細(xì)胞。將細(xì)胞通過30mm尼龍網(wǎng)或40mm預(yù)分離濾膜后，每支純化柱中加入2ml細(xì)胞。室溫孵育15min。

5. 用2ml 1×純化柱緩沖液洗滌純化柱4或5遍以洗脫T細(xì)胞。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)后，將細(xì)胞懸液在4℃，200g離心10min。

6. 將沉淀按每108 個(gè)細(xì)胞加0.9ml MACS緩沖液的比例混懸。每108 個(gè)細(xì)胞加入0.1ml CD8a（Ly-2）磁珠后4℃孵育15min。

7. 4℃，200g離心10min。

8. 以MACS緩沖液混懸細(xì)胞，使細(xì)胞濃度達(dá)到108 個(gè)細(xì)胞/ml。將細(xì)胞通過30mm尼龍網(wǎng)或40mm預(yù)分離濾膜。將細(xì)胞放到autoMACS的上樣通道。選擇depletes程序（CD4+ T細(xì)胞將從陰性通道洗脫。

9. 回收細(xì)胞計(jì)數(shù)，在4℃，200g離心10min。

10. 用結(jié)合緩沖液混懸細(xì)胞使其濃度達(dá)到108 個(gè)細(xì)胞/ml。每108 個(gè)細(xì)胞加入15mg biotin-抗CD25（7D4）。4℃孵育15min。4℃，200g離心10min。

11. 用結(jié)合緩沖液混懸細(xì)胞使其濃度達(dá)到108 個(gè)細(xì)胞/ml。每108 個(gè)細(xì)胞加入7.5mg Streptavidin-PE。4℃孵育15min。

12. 4℃，200g離心10min.

13. 用MACS緩沖液混懸細(xì)胞使其濃度達(dá)到108 個(gè)細(xì)胞/ml。每108 個(gè)細(xì)胞加入0.1ml 抗PE磁珠。4℃孵育15min。

14. 4℃，200g離心10min。

15. 用MACS緩沖液混懸細(xì)胞使其濃度達(dá)到108 個(gè)細(xì)胞/ml。將細(xì)胞放到autoMACS的上樣通道。選擇posseld程序（CD4+ CD25+ 細(xì)胞將從陽性通道洗脫，CD4+ CD25- 細(xì)胞將從陰性通道洗脫。