LaVision雙光子顯微鏡-多線掃描雙光子成像（一）
Journal of Neuroscience Methods 151 (2006) 276–286
Application of multiline two-photon microscopy to functional in vivo imaging
Rafael Kurtz a,?, Matthias Fricke b,1, Julia Kalb a,2,
Philip Tinnefeld b,3, Markus Sauer b,4
a Lehrstuhl f¨ur Neurobiologie, Universit¨at Bielefeld, Postfach 100131, D-33501 Bielefeld, Germany
b Lehrstuhl f¨ur Angewandte Laserphysik und Laserspektroskopie, Universit¨at Bielefeld,
Postfach 100131, D-33501 Bielefeld, Germany
Received 3 November 2005; received in revised form 28 November 2005; accepted 4 December 2005
摘要
??? 高空間分辨率和低的光損傷風(fēng)險(xiǎn)使得雙光子激光掃描顯微鏡TPLSM成為生物功能成像的選擇。但是，如神經(jīng)鈣離子調(diào)控等功能性動(dòng)態(tài)研究通常也需要一個(gè)高的時(shí)間分辨率。目前，通過(guò)線掃描可以獲取速度的提升，但是將結(jié)構(gòu)的空間分辨率限制在一條軸上。為克服高空間分辨率和高時(shí)間分辨率間的空白，我們改進(jìn)了TPLSM，使用一個(gè)多倍分光器來(lái)在樣品中產(chǎn)生多個(gè)激光焦點(diǎn)。通過(guò)使用一個(gè)電子倍增相機(jī)檢測(cè)這些焦點(diǎn)釋放的熒光，它可以支持同時(shí)進(jìn)行多條線掃描。除了多線掃描，高達(dá)64束的陣列也允許使用X-Y掃描模式去以高的幀速獲取整幅圖像。為估測(cè)多線掃描TPLSM在功能性原位成像中的應(yīng)用，監(jiān)測(cè)了蒼蠅大腦中的視覺(jué)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中的鈣離子信號(hào)。以分枝狀軸突和棘突狀結(jié)構(gòu)的測(cè)量為例展示了我們的方法對(duì)于從不同細(xì)胞位置同時(shí)獲取信號(hào)的能力。鈣離子動(dòng)態(tài)依賴于分支大小，但是“棘突”與他們的“母軸突”并沒(méi)有系統(tǒng)性的區(qū)別。我們?cè)O(shè)備的空間分辨率與激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行了嚴(yán)格比較并通過(guò)運(yùn)行成像和點(diǎn)掃描模式直接評(píng)估圖像檢測(cè)過(guò)程中釋放光散射的負(fù)面效應(yīng)。
? 2005 Elsevier B.V. All rights reserved.
Keywords: Two-photon; Microscopy; Calcium imaging; Temporal resolution; Beamsplitter; Visual system; Invertebrate
1.導(dǎo)論
??? 調(diào)查單個(gè)神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)回路內(nèi)的動(dòng)態(tài)過(guò)程通常要求對(duì)神經(jīng)活動(dòng)具有高時(shí)間分辨率和空間分辨率的成像。傳統(tǒng)寬視野熒光顯微鏡對(duì)完整組織的空間分辨率受到光散射的嚴(yán)重影響。另一方面，時(shí)間分辨率受到CCD在弱光條件下獲取圖像所需時(shí)間的限制。
??? 激光掃描顯微鏡尤其是TPLSM，在散射性組織中可能提供了比傳統(tǒng)成像方式更高的空間分辨率，并允許基于不同焦平面的圖像系列的三維重構(gòu)(for review see: Halbhuber and K¨onig, 2003; Helmchen and Denk, 2002; Wright and Wright, 2002; Zipfel et al., 2003).激光掃描顯微鏡的更高的空間分辨率事實(shí)上取決于受到樣品內(nèi)激光焦點(diǎn)限制的信號(hào)檢測(cè)（共聚焦顯微鏡）或激發(fā)本身（TPLSM）。
??? 但是，成像速率是激光顯微鏡中的一個(gè)問(wèn)題：例如，當(dāng)激光沿著一個(gè)軸重復(fù)掃描時(shí)，只有在線掃描中，獲取率通?？梢陨仙矫棵霂装賯€(gè)樣品。相對(duì)而言，掃描整幅圖像或者在Z平面進(jìn)行圖像堆棧與傳統(tǒng)寬視場(chǎng)熒光成像同樣耗費(fèi)時(shí)間。當(dāng)在不能用單條線掃描完全涵蓋的多個(gè)神經(jīng)結(jié)構(gòu)功能性信號(hào)比較時(shí)，它存在很大的問(wèn)題。不幸的是非同時(shí)性的多個(gè)線位置連續(xù)數(shù)據(jù)收集通常不是一個(gè)能說(shuō)明問(wèn)題的選擇，因?yàn)樵趯?shí)驗(yàn)間變異性很大的神經(jīng)元響應(yīng)中它得出的結(jié)論太間接。(see e.g. Passaglia and Troy, 2004; Warzecha and Egelhaaf,1999). 在獲取整幅圖像時(shí)提高時(shí)間分辨率的技術(shù)，例如轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡，雖然有新的發(fā)展，在活樣品的致密組織應(yīng)用中獲得的信號(hào)過(guò)于微弱。 (see e.g. Coates et al., 2004; Nakano, 2002).
??? 在這個(gè)研究中，我們調(diào)查了是否多線TPLSM能夠幫助克服在功能性成像中時(shí)間分辨率和空間分辨率間的權(quán)衡。
??? 多線TPLSM的原理以基于鏡面的光束分光器為基礎(chǔ)，它可以把一束激光分解成多束(Nielsen et al., 2001).在TPLSM中，激發(fā)內(nèi)在性限定在激光很小的焦點(diǎn)處，這個(gè)分光器可以在樣品的焦平面上產(chǎn)生多個(gè)這種激發(fā)點(diǎn)。我們證明這種多焦點(diǎn)模式可以有效地用于同時(shí)執(zhí)行多個(gè)線掃描。而且，使用多激光焦點(diǎn)掃描時(shí)圖像的獲取速度會(huì)提高，因?yàn)槊織l光線只掃描圖像的一部分，或者每個(gè)樣品點(diǎn)被多條光束成功激發(fā)。近來(lái)，一個(gè)相似的光束分光器設(shè)計(jì)已經(jīng)被提議用到熒光壽命成像上。 (Leveque-Fort et al., 2004).
??? 對(duì)正常動(dòng)物的成像是功能性成像最具挑戰(zhàn)性的工作 (for review see: Helmchen andWaters, 2002).我們使用蒼蠅視覺(jué)系統(tǒng)的神經(jīng)元鈣離子動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)作為多線TPLSM的關(guān)鍵測(cè)試。Blowfly大腦中的視覺(jué)運(yùn)動(dòng)處理區(qū)域，小葉板，包含了60個(gè)大的可獨(dú)立識(shí)別的方向選擇性神經(jīng)元，所謂的切向細(xì)胞TC。(for reviews see Borst and Haag, 2002; Egelhaaf and Borst, 1993; Egelhaaf et al., 1988, 2002, 2005). 這些神經(jīng)元已經(jīng)成為研究近乎自然狀況下神經(jīng)信息處理的唯一模型系統(tǒng)。在電生理學(xué)與光學(xué)記錄實(shí)驗(yàn)中，TC表現(xiàn)出作為運(yùn)動(dòng)感受器的功能，每一個(gè)神經(jīng)元被以一種特殊的方式裁剪以適應(yīng)來(lái)自移動(dòng)中眼睛產(chǎn)生的動(dòng)態(tài)模式的光流信息的精確明顯的組分(D¨urr et al., 2001; Egelhaaf et al., 1993; Krapp and Hengstenberg, 1996; Single and Borst, 1998). 由于來(lái)自外周局部動(dòng)作敏感神經(jīng)元的神經(jīng)信號(hào)的視網(wǎng)膜拓?fù)淙覶C具有大的感受域。而且，TC間的相互作用大大增加了感受野的大小和動(dòng)作特異性(Haag and Borst, 2001; Horstmann et al., 2000).
??? 使用鈣離子成像作為TC局部樹(shù)突活化的標(biāo)記(Borst and Egelhaaf, 1992; D¨urr and Egelhaaf, 1999; Haag et al., 2004; Single and Borst, 1998). 而且，有證據(jù)表明樹(shù)突鈣離子的增加卷入了活性依賴的動(dòng)作靈敏度度的調(diào)控，如動(dòng)作調(diào)整 (Kurtz et al., 2000). 突觸鈣離子濃度改變的成像已經(jīng)被用于描繪感受刺激中的分級(jí)突觸傳遞的特點(diǎn)。(Kurtz et al., 2001). 在所有這種組織中，更高空間和時(shí)間分辨率的鈣離子成像將幫助我們得出更直接的結(jié)論，例如樹(shù)突輸入整合，突觸傳導(dǎo)中的鈣離子動(dòng)態(tài)調(diào)控和通過(guò)鈣離子的動(dòng)作調(diào)節(jié)的潛在時(shí)空控制。
??? 除了它的優(yōu)越性能和在致密組織的深層激發(fā)過(guò)程中降低的光損傷之外，由于使用近紅外波段激發(fā)，也避免了光感受器的視覺(jué)激發(fā)，TPLSM成為原位成像中的一種方法選擇，尤其適用于視覺(jué)系統(tǒng)。(see e.g. Denk and Detwiler, 1999; Euler et al., 2002). 通常，共聚焦和傳統(tǒng)成像通常伴隨著不需要的視覺(jué)激發(fā)，因?yàn)闊晒馊玖系膯喂庾蛹ぐl(fā)光譜與光感受器的感受范圍存在很大的重疊。蒼蠅的視覺(jué)系統(tǒng)首次被用來(lái)通過(guò)單線掃描和一個(gè)雪崩二極管監(jiān)測(cè)鈣離子信號(hào)來(lái)檢驗(yàn)原位TPLSM成像(Kalb et al., 2004). 之后，Haag et al. (2004) 分析了條紋模式的動(dòng)作中TC中的局部樹(shù)突鈣離子震動(dòng)，以得出TC的局部動(dòng)作檢測(cè)器輸入的計(jì)算模式。在后者的研究中，獲得了64×64像素的圖像，但是鈣離子成像的時(shí)間分辨率只有8Hz。相對(duì)的, Kalb et al.(2004) 獲得了高達(dá)400Hz時(shí)間分辨率的單線掃描圖像，空間分辨率限制在10um的一條線。當(dāng)前的研究首次表明TPLSM中的多線原理可以被如何有效地應(yīng)用以彌補(bǔ)神經(jīng)活動(dòng)功能成像中時(shí)間分辨率與空間分辨率之間的空白。
