（雙光子、共聚焦）熒光顯微鏡和普通顯微鏡的區(qū)別
最近試著做了一些小鼠的冰凍切片，接下來要使用熒光顯微鏡看自己打的病毒是否在自己想要的腦區(qū)。熒光顯微鏡的一些基本原理需要簡(jiǎn)單學(xué)習(xí)一下，也在此分享一下。
熒光顯微鏡是利用紫外線為光源，用以照射被檢驗(yàn)的物體，使該物體發(fā)出光源，然后在顯微鏡下進(jìn)行對(duì)物體的觀察。主要是用于免疫熒光細(xì)胞，主要是由光源、濾板系統(tǒng)和光學(xué)系統(tǒng)組成的在通過目鏡和物鏡的放大來觀察樣本的熒光圖像。我們來看下這熒光顯微鏡和普通光學(xué)顯微鏡有什么樣的區(qū)別。
1、在照明方式上看
熒光顯微鏡的照明方式一般是用落射式，也就是說光源是通過物鏡來投放于試驗(yàn)樣本上。
2、在分辨率上看
熒光顯微鏡利用的是紫外線做為光源，波長(zhǎng)比較短，但是分辨率卻高于普通的光學(xué)顯微鏡。
3、在濾光片上的不同
熒光顯微鏡是用了兩個(gè)特殊的濾光片，在光源前用是用來濾出可見光，在物鏡和目鏡之間的使用來濾出紫外線，這樣可以保護(hù)人的眼睛。
熒光顯微鏡也屬于光學(xué)顯微鏡的一種，主要是熒光顯微鏡所激發(fā)的波長(zhǎng)短，所以這才導(dǎo)致了熒光顯微鏡和普通顯微鏡雜結(jié)構(gòu)構(gòu)造和使用上的不同，熒光顯微鏡大都有良好的捕捉弱光的功能，所以在極其微弱的熒光下，它的成像能力也和好。再加上近年來對(duì)熒光顯微鏡的不斷改善，噪音也大幅度降低。因此越來越多的熒光顯微鏡得到應(yīng)用。
雙光子熒光顯微鏡有關(guān)知識(shí)
雙光子激發(fā)的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收 2 個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子，在經(jīng)過一個(gè)很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時(shí)間后，發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)較短的光子；其效果和使用一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，為了不損傷細(xì)胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脈沖寬度只有 100飛秒，而其頻率可以達(dá)到 80 至 100 兆赫。在使用高數(shù)值孔徑的物鏡將脈沖激光的光子聚焦時(shí)，物鏡的焦點(diǎn)處的光子密度是最高的，雙光子激發(fā)只發(fā)生在物鏡的焦點(diǎn)上，所以雙光子顯微鏡不需要共聚焦針孔，提高了熒光檢測(cè)效率。
在一般的熒光現(xiàn)象中，由于激發(fā)光的光子密度低，一個(gè)熒光分子只能同時(shí)吸收一個(gè)光子，再通過輻射躍遷發(fā)射一個(gè)熒光光子，這就是單光子熒光。對(duì)于以激光為光源的熒光激發(fā)過程，則可能產(chǎn)生雙光子甚至多光子熒光現(xiàn)象，這時(shí)所用的激發(fā)光源強(qiáng)度高，光子密度滿足熒光分子同時(shí)吸收兩個(gè)光子的要求。以一般的激光為激發(fā)光源的過程中，光子密度仍然不足以產(chǎn)生雙光子吸收現(xiàn)象，通常采用飛秒脈沖激光器，其瞬時(shí)功率可以達(dá)到兆瓦量級(jí)。因此，雙光子熒光的波長(zhǎng)比激發(fā)光的波長(zhǎng)短，相當(dāng)于半激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)產(chǎn)生的效果。
雙光子熒光顯微鏡有很多優(yōu)點(diǎn)：
1）長(zhǎng)波長(zhǎng)的光比短波長(zhǎng)的光受散射影響較小容易穿透標(biāo)本；
2）焦平面外的熒光分子不被激發(fā)使較多的激發(fā)光可以到達(dá)焦平面，使激發(fā)光可以穿透更深的標(biāo)本；
3）長(zhǎng)波長(zhǎng)的近紅外光比短波長(zhǎng)的光對(duì)細(xì)胞毒性小；
4）使用雙光子顯微鏡觀察標(biāo)本的時(shí)候，只有在焦平面上才有光漂白和光毒性。所以，雙光子顯微鏡比單光子顯微鏡更適合用來觀察厚標(biāo)本、更適合用來觀察活細(xì)胞、或用來進(jìn)行定點(diǎn)光漂白實(shí)驗(yàn)。
共聚焦熒光顯微鏡有關(guān)知識(shí)
共聚焦熒光顯微鏡基本原理：采用點(diǎn)光源照射標(biāo)本，在焦平面上形成一個(gè)輪廓分明的小的光點(diǎn)，該點(diǎn)被照射后發(fā)出的熒光被物鏡收集，并沿原照射光路回送到由雙向色鏡構(gòu)成的分光器。分光器將熒光直接送到探測(cè)器。光源和探測(cè)器前方都各有一個(gè)針孔，分別稱為照明針孔和探測(cè)針孔。兩者的幾何尺寸一致，約100-200nm；相對(duì)于焦平面上的光點(diǎn)，兩者是共軛的，即光點(diǎn)通過一系列的透鏡，最終可同時(shí)聚焦于照明針孔和探測(cè)針孔。這樣，來自焦平面的光，可以會(huì)聚在探測(cè)孔范圍之內(nèi)，而來自焦平面上方或下方的散射光都被擋在探測(cè)孔之外而不能成像。以激光逐點(diǎn)掃描樣品，探測(cè)針孔后的光電倍增管也逐點(diǎn)獲得對(duì)應(yīng)光點(diǎn)的共聚焦圖像，轉(zhuǎn)為數(shù)字信號(hào)傳輸至計(jì)算機(jī)，最終在屏幕上聚合成清晰的整個(gè)焦平面的共聚焦圖像。
每一幅焦平面圖像實(shí)際上是標(biāo)本的光學(xué)橫切面，這個(gè)光學(xué)橫切面總是有一定厚度的，又稱為光學(xué)薄片。由于焦點(diǎn)處的光強(qiáng)遠(yuǎn)大于非焦點(diǎn)處的光強(qiáng)，而且非焦平面光被針孔濾去，因此共聚焦系統(tǒng)的景深近似為零，沿Z軸方向的掃描可以實(shí)現(xiàn)光學(xué)斷層掃描，形成待觀察樣品聚焦光斑處二維的光學(xué)切片。把X-Y平面（焦平面）掃描與Z軸（光軸）掃描相結(jié)合，通過累加連續(xù)層次的二維圖像，經(jīng)過專門的計(jì)算機(jī)軟件處理，可以獲得樣品的三維圖像。
即檢測(cè)針孔和光源針孔始終聚焦于同一點(diǎn)，使聚焦平面以外被激發(fā)的熒光不能進(jìn)入檢測(cè)針孔。
激光共聚焦的工作原理簡(jiǎn)單表達(dá)就是它采用激光為光源，在傳統(tǒng)熒光顯微鏡成像的基礎(chǔ)上，附加了激光掃描裝置和共軛聚焦裝置，通過計(jì)算機(jī)控制來進(jìn)行數(shù)字化圖像采集和處理的系統(tǒng)。
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會(huì)議會(huì)展
