體外診斷產(chǎn)品相關(guān)原材料（四）
四、載體
1，免疫層析技術(shù)
快速診斷試紙條是20世紀(jì)90年代在單克隆抗體技術(shù)、膠體金免疫層析技術(shù)和新材料技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一項(xiàng)新型體外診斷技術(shù)，具有快速、簡便、單人份檢測(cè)、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)（圖1）,現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢測(cè)、食品質(zhì)量監(jiān)測(cè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)、農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)、出入境檢驗(yàn)檢疫、法醫(yī)定案等領(lǐng)域。
膠體金免疫層析技術(shù)
膠體金免疫層析技術(shù)以大孔徑的微孔濾膜（NC膜，硝酸纖維素膜）為載體，將特異性的抗原或抗體以條帶狀固定在NC膜上，當(dāng)待測(cè)樣品加到試紙條一端的樣品墊上后，通過毛細(xì)作用向前移動(dòng)，與結(jié)合墊上的膠體金標(biāo)記試劑發(fā)生特異的免疫反應(yīng)，再移動(dòng)到NC膜上，被固定在NC膜表面的抗原或抗體捕獲，聚集在檢測(cè)帶上，通過目測(cè)硝酸纖維素表面標(biāo)記物（膠體金或乳膠顆粒）的光反射信號(hào)的密度得到直觀的顯色結(jié)果。其它未結(jié)合的標(biāo)記物則越過檢測(cè)帶，流入吸水墊中，達(dá)到自動(dòng)分離的目的（圖2）。
2.膜的挑選與關(guān)鍵性能指標(biāo)
蛋白結(jié)合能力
對(duì)于側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l，硝酸纖維素高分子聚合物的表面積決定了有多少蛋白可以固定于NC膜上。NC膜的表面積主要由膜的孔徑、成孔率（膜的單位體積內(nèi)的空氣百分比含量）、厚度以及多孔結(jié)構(gòu)所決定。在其他參數(shù)都相同的條件下，膜的表面積與孔徑呈非線性反比關(guān)系；與厚度成線性正比關(guān)系；與成孔率呈非線性正比關(guān)系。以孔徑0.1um硝酸纖維素膜為例，它的表面積是孔徑10um濾膜的10倍，而非100倍。由膜的多孔結(jié)構(gòu)形成的總表面積通常用m2/g表示，膜的基重容易測(cè)量，用g/ m2表示，二者相乘即比表面積，可表示為：內(nèi)部總表面積/膜的平面面積。對(duì)于孔徑非常小的膜（如：0.1um濾膜），比表面積可達(dá)2000，而對(duì)用于側(cè)向?qū)游錾系拇罂讖降哪?，比表面積通常在50-200范圍內(nèi)。
NC膜與蛋白的結(jié)合能力主要由蛋白的斯托克斯半徑及三維結(jié)構(gòu)決定。以IgG為例，蛋白載量約為1μg/cm2，用蛋白載量（1μg/cm2）乘以層析膜的比表面積（50-200）可以估算出單位面積IgG與NC膜的結(jié)合量約為50-200μg/cm2。如果試紙條寬1cm，T線寬度1mm，那么IgG的結(jié)合量約為5-20μg （0.1 cm 寬 x 1 cm 長 = 0.1 cm2)。由此可見，NC膜對(duì)于IgG的靜態(tài)結(jié)合能力約為市場(chǎng)上大部分檢測(cè)項(xiàng)目要求的10-100倍，NC膜對(duì)蛋白的結(jié)合能力完全可以滿足IVD生產(chǎn)企業(yè)的要求。
硝酸纖維素膜主要通過靜電吸附作用與蛋白結(jié)合（圖3）。盡管硝酸纖維素屬中性，其與蛋白的結(jié)合不受pH值的影響，但是pH值仍可通過影響蛋白在噴膜緩沖液中的穩(wěn)定狀態(tài)進(jìn)而影響蛋白與膜的結(jié)合。噴膜時(shí)，諸如Tween 20 和Triton? X-100等離液劑應(yīng)盡量避免，或者控制其使用濃度在0.01% v/v以下。這些物質(zhì)會(huì)干擾蛋白與膜的結(jié)合，如果噴膜緩沖液中加入此類物質(zhì)，可能會(huì)出現(xiàn)樣品流經(jīng)T/C線時(shí)信號(hào)出現(xiàn)，隨后固定在NC膜上的抗原或抗體從膜上洗脫下來，信號(hào)消失的現(xiàn)象。如果出于降低非特異性結(jié)合或反應(yīng)背景的目的需要加入離液劑，通常建議加在樣品墊中。
毛細(xì)流動(dòng)速度
毛細(xì)流動(dòng)速度通常指樣品的液流前鋒流經(jīng)NC膜時(shí)的遷移速度。毛細(xì)流動(dòng)速度比較難測(cè)量，隨著樣品遷移距離的加長，毛細(xì)流動(dòng)速度開始逐漸變慢。為了便于衡量NC膜在側(cè)向?qū)游鲋械恼w表現(xiàn)，NC膜的生產(chǎn)廠商引入了毛細(xì)流動(dòng)時(shí)間的概念。毛細(xì)流動(dòng)時(shí)間體現(xiàn)的是液體在NC膜上遷移一定距離（通常為4cm）所用的時(shí)間。以默克HF135型號(hào)的膜為例，其含義是純水在50 +/- 5% R.H. and 21 +/- 1.5°C條件下流過4cm距離所用的時(shí)間是135秒。
NC膜的毛細(xì)流動(dòng)速度對(duì)于側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l的性能至關(guān)重要。默克是全球第一家生產(chǎn)側(cè)向?qū)游瞿さ纳a(chǎn)商，也是首家將毛細(xì)流動(dòng)時(shí)間作為層析膜質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的公司。NC膜的毛細(xì)流動(dòng)時(shí)間與試紙條的靈敏度關(guān)系如下（圖4）：
試紙條上的免疫反應(yīng)是一個(gè)動(dòng)態(tài)體系，在判讀結(jié)果的時(shí)候免疫反應(yīng)并沒有達(dá)到平衡。C/T線上的信號(hào)強(qiáng)度取決于各個(gè)組分在分子水平上足夠接近，形成免疫復(fù)合物的有限時(shí)間。毛細(xì)流動(dòng)速度決定了這一時(shí)間的長短。樣本中待檢物的有限濃度與毛細(xì)流動(dòng)速度的平方呈反比（圖5）。例如，當(dāng)毛細(xì)流動(dòng)速度由X增加到1.25X時(shí)，樣本中待檢物的有效濃度則降低了36% (1-(1/1.252))。
此外，我們也可以用抗原抗體免疫復(fù)合物結(jié)合公式來理解這一概念。R表示在C/T線形成的抗原抗體復(fù)合物的總量，R等于K（抗原抗體的親和系數(shù)）乘以抗原和抗體的濃度，當(dāng)流速為1X時(shí)，R = k[Ab][Ag]。假設(shè)流速由1X增加到2X，那么抗原與抗體在分子水平上足夠接近形成免疫復(fù)合物的時(shí)間就縮短了一半，盡管抗原抗體的實(shí)際濃度沒有任何改變，但是他們的有效濃度均降低到原來的一半，用公式表示為：R = k[0.5 x Ab][0.5 x Ag] = 0.25 k[Ab][Ag]，相當(dāng)于樣本中的待檢物濃度降低到原來的四分之一。因此，如果我們將流速為180秒/4cm（如HF180）的膜換成流速為90秒/4cm（如HF090）的膜，產(chǎn)品的靈敏度會(huì)降低4倍。在某些產(chǎn)品上，即便通過增加捕獲抗體或檢測(cè)抗體的濃度也難以彌補(bǔ)由于膜的流速加快而導(dǎo)至的靈敏度的降低。而且，通過增加抗體的使用量來提高產(chǎn)品靈敏度，會(huì)帶來產(chǎn)品成本上升，特異性下降等問題。
另一個(gè)需要考慮的因素是樣品在NC膜上的遷移速度會(huì)隨距離的加長而以指數(shù)方式降低。例如，樣品由X cm遷移到2X cm所用時(shí)間是從起點(diǎn)到X cm距離的2倍；也就是說如果樣品用1分鐘的時(shí)間從起點(diǎn)遷移到1cm距離，那么遷移到下一個(gè)1cm所用的時(shí)間通常要2分鐘以上。因此，T線距離起點(diǎn)的位置對(duì)于層析試紙條的靈敏度有很大影響。T線的位置距離原點(diǎn)越遠(yuǎn)，樣品到達(dá)T線位置時(shí)的速度越慢，樣品的有效濃度就越高，靈明度也相應(yīng)越高。
既然樣品經(jīng)過C/T線時(shí)的速度決定了其有效濃度，由于C線與T線不在同一位置，因此樣品中的待檢物與C線和T線的結(jié)合動(dòng)力學(xué)也不盡相同。對(duì)于多重檢測(cè)項(xiàng)目（在同一試紙條上檢測(cè)兩種以上的待檢物）亦是如此。距離原點(diǎn)最近的T線由于樣品流速快，因此需要使用更多的捕獲抗體或檢測(cè)抗體。在設(shè)計(jì)產(chǎn)品的時(shí)出于成本考慮可以將抗原抗體親和系數(shù)較高的檢測(cè)項(xiàng)目放在最前面。
毛細(xì)流動(dòng)速度除影響產(chǎn)品靈敏度外，也會(huì)在一定程度上改變C/T線的形態(tài)。C/T線在流速快的膜上線條較粗，在流速慢的膜上線條則較細(xì)。使用流速快的膜（如HF75）在檢測(cè)弱陽的樣本時(shí)可能會(huì)帶來一些問題，影響產(chǎn)品的最低檢出限度。
厚度
膜的厚度對(duì)于層析試紙條的影響主要有以下幾個(gè)方面，分別是：床體積、C/T線寬度、拉伸強(qiáng)度及C/T線信號(hào)的可視性。
床體積
如果試紙條不使用吸水墊，NC膜的床體積將決定可供檢測(cè)的樣品量，膜越厚，床體積也越大。對(duì)于1cm X 5cm，厚度為130μm的膜，其體積為0.065 cm3（長X寬X厚度），如果膜的成孔率為70%，那么它的床體積應(yīng)為：45.5 μL (0.7 x 65 μL)。如果NC膜的厚度由130μm變?yōu)?10μm，那么其床體積將減少為38.5 μL；相反，如果NC膜的厚度變?yōu)?30μm，其床體積將增加到52.5 μL。因此，如果沒有吸水墊，NC膜厚度的改變將顯著影響可供檢測(cè)的樣品量。當(dāng)然，如果試紙條使用吸水墊，則待檢的樣品量主要由吸水墊的床體積決定。
C/T線寬度
膜的厚度也會(huì)影響C/T線的寬度。如果噴膜的體積一定，則越薄的膜，C/T線越寬，越厚的膜C/T線越窄。由于抗原或抗體的使用量沒有改變，因此，越薄的膜，側(cè)向擴(kuò)散距離越遠(yuǎn)，在C/T線上產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度也會(huì)越低，進(jìn)而影響試紙條的靈敏度。
拉伸強(qiáng)度
拉伸強(qiáng)度指在多大的力作用下可以將膜拉斷，通常NC膜的孔徑越大，厚度越薄則越容易拉斷。用于層析的NC膜屬于大孔徑的膜，因此，如果沒有背襯，此類膜較其它材質(zhì)的膜更容易損壞。側(cè)向?qū)游瞿さ睦鞆?qiáng)度通常介于1.75到8.8牛頓/cm之間。帶有背襯的NC膜很好的克服了這一缺點(diǎn)，與不帶背襯的NC膜相比更易操作，降低了用戶的生產(chǎn)損耗率。
C/T線信號(hào)的可視性
厚的膜能夠吸收更多的樣品，增加了到達(dá)C/T線的樣品總量，因此，靈敏度也應(yīng)該更高。但是這一優(yōu)勢(shì)被NC膜的固有性質(zhì)所抵消。由于NC膜的光學(xué)特點(diǎn)，人的肉眼只能觀測(cè)到膜表面10μm以內(nèi)的區(qū)域（圖6），用公式表示如下：%肉眼觀測(cè)信號(hào)=可見深度（10μm）/膜的厚度。越厚的膜，肉眼可見信號(hào)的百分比也越低。這足以抵消掉由于床體積增加帶來的靈敏度的提升。
表面活性劑
NC主要由硝酸纖維素的高分子聚合物組成，硝酸纖維素是疏水的，為了使膜能夠潤濕，需要在NC膜的生產(chǎn)過程中加入表面活性劑，表面活性劑對(duì)層析膜的性能影響主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面（圖7）：
影響毛細(xì)流動(dòng)速度
為了使膜能夠潤濕，通常需要加入一定濃度的表面活性劑。如果在此基礎(chǔ)上繼續(xù)提高表面活性劑的濃度，液體側(cè)向流動(dòng)的均一性會(huì)有所改善，但是膜的潤濕性能幾乎不會(huì)有任何變化。通常，表面活性劑的種類及使用濃度對(duì)于特定的NC膜生產(chǎn)商來說是相對(duì)固定的。
影響蛋白吸附
表面活性劑無論從NC膜還是噴膜緩沖液的角度講都會(huì)對(duì)蛋白吸附造成影響。如果NC的表面活性劑濃度過高，會(huì)妨礙蛋白與NC膜的結(jié)合。噴膜緩沖液中的表面活性劑濃度對(duì)蛋白結(jié)合影響更大。以生產(chǎn)上常用的Tween R 20、Triton? X-100、PVA、PVP、PEG等表面活性劑為例，其主要通過與NC膜或者抗原/抗體結(jié)合來降低蛋白與膜的結(jié)合能力，特別是當(dāng)表面活性劑的使用濃度高于CMC（臨界膠束濃度）濃度時(shí)尤為如此。如果表面活性劑作為封閉劑的組成成分必須添加到系統(tǒng)中，通常建議使用的濃度越低越好，以防止表面活性劑將固定到膜上的抗原或抗體置換下來。表面活性劑推薦濃度如下：Tween R /Triton? X-100 20為0.05% v/v；PVA, PVP和PEG為< 0.5% w/v。
對(duì)于噴膜過程及線條寬度的影響
噴膜過程的均一性受到NC膜潤濕性能的影響。提高表面活性劑的使用濃度可以改善液體側(cè)向流動(dòng)的均一性，進(jìn)而改善C/T線的線條寬度。然而，如果表面活性劑濃度過高，噴膜時(shí)的水線也會(huì)變寬。需要特別指出的是，水線與抗原/抗體結(jié)合到膜上形成的C/T蛋白線是兩個(gè)概念，在絕大多數(shù)情況下，抗原/抗體分子與NC膜高分子聚合物的結(jié)合是瞬時(shí)發(fā)生的，只有噴膜緩沖液中的化學(xué)試劑組分或者被化學(xué)封閉的蛋白才會(huì)在液體的毛細(xì)作用下向C/T線條的上下兩個(gè)方向側(cè)向遷移。我們?cè)趪娔み^程中看到的水線往往比C/T蛋白線要寬一些，水線的寬窄無法準(zhǔn)確預(yù)測(cè)蛋白線條的質(zhì)量。
NC膜的儲(chǔ)存條件
NC膜保存時(shí)應(yīng)避免與易揮發(fā)的有機(jī)溶劑接觸，有機(jī)溶劑可與NC膜結(jié)合使膜變得疏水而無法使用。我們推薦的長期儲(chǔ)存條件為10-25℃, 30-70% RH（相對(duì)濕度），產(chǎn)品應(yīng)放置于陰涼、干燥、通風(fēng)的環(huán)境，避免陽光直射造成局部過熱。
免疫層析技術(shù)熱點(diǎn)與新方向
隨著免疫層析技術(shù)的飛速發(fā)展，定量、高靈敏度、多元檢測(cè)、層析系統(tǒng)集成化，開始成為該領(lǐng)域新的研究方向，彩色微球、熒光微球以及磁珠已經(jīng)成為繼膠體金之后的新一代抗原/抗體標(biāo)記物。與傳統(tǒng)的膠體金相比，乳膠微球及磁珠具有良好的穩(wěn)定性，線性范圍寬，靈敏度高，非常適用于定量免疫層析檢測(cè)中。
根據(jù)免疫層析試紙條所選標(biāo)記物直徑的不同，NC膜的適應(yīng)性也有所不同。如果選擇直徑較大的乳膠顆粒（300-400nm），則只能選擇孔徑稍大，流速在HF135以下的NC膜，不同粒徑的標(biāo)記物在NC膜上的流動(dòng)情況如下（圖8）：
圖4.9-18不同粒徑的標(biāo)記物在Hi-Flow PlusTM 系列硝酸纖維素膜上的流動(dòng)情況
以目前市場(chǎng)上應(yīng)用最為廣泛的熒光微球（圖9）為例，制作微球最為常用的材質(zhì)為聚苯乙烯（PS）材料，熒光染料先通過膨脹的方法鑲嵌在微球孔隙中，再使微球收縮，用物理的方法將染料不可逆地包埋在微球內(nèi)部。對(duì)于無任何功能基團(tuán)修飾的微球，抗原或抗體通過被動(dòng)吸附作用固定在微球表面。對(duì)于有功能基團(tuán)修飾的微球，抗原/抗體可通過共價(jià)交聯(lián)的方式固定在微球表面?？乖?抗體的共價(jià)交聯(lián)方法主要有兩種，一種是兩步法，交聯(lián)前微球需先進(jìn)行NHS/EDC活化，如-COOH羧基修飾的微球多采用此種方法；另一種是一步法，微球交聯(lián)前只需更換緩沖液的pH值即可活化，操作方便，如新一代的-Tosyl、-CH2Cl修飾的微球就屬此類。在產(chǎn)品開發(fā)初期，建議挑選三種不同粒徑的微球（如最為常用的100nm、300nm、500nm等）同時(shí)進(jìn)行評(píng)估，以確定最佳微球尺寸。隨后對(duì)于選定的微球可以再選取不同濃度的功能基團(tuán)（可分為高、中、低三檔）以確定最佳的功能基團(tuán)濃度。挑選微球過程中應(yīng)關(guān)注以下幾個(gè)方面：
l 微球熒光強(qiáng)度高、均一性好，在效期內(nèi)穩(wěn)定性好。
l 供應(yīng)商能夠提供多種粒徑供選擇（50nm-500nm）
l 功能基團(tuán)選擇靈活，如COOH、NH2、CH2Cl等，
l 有多重?zé)晒夤┻x擇以滿足不同激發(fā)光源需求（如U、X、XC、Y、Z等）
l 客戶批次驗(yàn)證合格后，供應(yīng)商可依客戶需求為客戶保留相應(yīng)批次。
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圖4.9-19 Estapor? 熒光微球
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焦點(diǎn)事件
