「2023第四屆中國(guó)（北京）生物藥工藝高峰論壇」熱蛋白質(zhì)組學(xué)分析(TPP)在藥物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用

2023.8.24

熱蛋白質(zhì)組學(xué)(TPP)是基于蛋白質(zhì)在受熱時(shí)變性溶解度降低的原理。蛋白質(zhì)可以在與小分子(如藥物或代謝物)、核酸或其他蛋白質(zhì)相互作用時(shí)或在翻譯后修飾時(shí)改變其熱穩(wěn)定性。TPP使用基于多重定量質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)來(lái)監(jiān)測(cè)數(shù)千種表達(dá)蛋白質(zhì)的熔解曲線。重要的是，這種方法可以在體外或在體內(nèi)進(jìn)行。它已被成功地應(yīng)用于識(shí)別藥物的靶標(biāo)和非靶標(biāo)，或研究蛋白質(zhì)-代謝物和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。因此，TPP為蛋白質(zhì)在原生環(huán)境和蛋白質(zhì)組范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)狀態(tài)和相互作用提供了獨(dú)特的見(jiàn)解，使我們能夠研究基本的生物學(xué)過(guò)程及其潛在的機(jī)制。接下來(lái)介紹一篇TPP的應(yīng)用案例。

寄生蟲(chóng)(線蟲(chóng))會(huì)導(dǎo)致破壞性疾病，給世界各地的人類(lèi)和其他動(dòng)物帶來(lái)巨大的痛苦。這些寄生蟲(chóng)的控制在很大程度上依賴(lài)驅(qū)蟲(chóng)療法，但治療失敗和對(duì)這些藥物的耐藥性普遍存在。由于開(kāi)發(fā)針對(duì)寄生線蟲(chóng)的疫苗在很大程度上沒(méi)有成功，人們?cè)絹?lái)越重視發(fā)現(xiàn)新的驅(qū)蟲(chóng)方法來(lái)對(duì)抗抗藥性蠕蟲(chóng)。2022年10月14日，Frontiers in Pharmacology雜志(IF:5.988)上在線發(fā)表了題為“Thermal proteome profiling reveals Haemonchus orphan protein HCO_011565 as a target of the nematocidal small molecule UMW-868”的研究論文。該研究采用熱蛋白質(zhì)組學(xué)(TPP)來(lái)探索HIT藥理學(xué)。利用的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和對(duì)接工具，推斷出驅(qū)蟲(chóng)小分子（HIT化合物：UMW-868）在高致病性捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)（Haemonchus contortus）和其他具有重要社會(huì)經(jīng)濟(jì)意義的寄生線蟲(chóng)中的全新寄生蟲(chóng)特異性靶標(biāo)(HCO_011565)。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

經(jīng)UMW-868處理的H.?Contortus?xL3s和對(duì)照組H.?Contortus?xL3s；分別在10個(gè)溫度梯度處理下的TPP熱蛋白組研究。

研究思路

研究結(jié)果

UMW-868在H. contortus中引起主要細(xì)胞死亡，而對(duì)哺乳動(dòng)物肝細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞毒性或有絲分裂毒性

作者測(cè)量了經(jīng)UMW-868處理的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)xL3s的細(xì)胞死亡。暴露90小時(shí)后，在UMW-868-處理的xL3s（>5μM）中檢測(cè)到細(xì)胞死亡，而用非活性類(lèi)似物（A-3155）處理的xL3s仍然存活（圖1A）。在50μM時(shí)，UMW-868可100%殺死處理過(guò)的xL3s，其IC50值為34.8uM(圖1B)。暴露于UMW-868 168h后，幼蟲(chóng)全身可見(jiàn)死亡細(xì)胞(圖1C)，而暴露于A-3155或DMSO的xL3s則未檢測(cè)到死亡細(xì)胞(圖1C)。接下來(lái)測(cè)試了UMW-868對(duì)HepG2細(xì)胞和線粒體的毒性；UMW-868在高達(dá)100μM的濃度下沒(méi)有表現(xiàn)出任何明顯的細(xì)胞毒性或有絲分裂毒性(圖1D)。

圖1.?化合物UMW-868的生物測(cè)定表征

孤兒蛋白HCO_011565是UMW-868靶標(biāo)的證據(jù)

前期實(shí)驗(yàn)證明了UMW-868具有驅(qū)蟲(chóng)活性，并且對(duì)哺乳動(dòng)物肝細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞或線粒體毒性，接下來(lái)的目標(biāo)是確定該化合物的作用靶點(diǎn)。利用熱蛋白質(zhì)組學(xué)(TPP)，共鑒定和定量了3,678個(gè)蛋白。通過(guò)非參數(shù)響應(yīng)曲線分析(NPARC)評(píng)估定量蛋白質(zhì)的熱熔曲線，將非參數(shù)模型與溫度曲線數(shù)據(jù)擬合后，得到了2,591條不同的熔解曲線圖譜。經(jīng)過(guò)篩選共鑒定了55種蛋白質(zhì)，它們的熱穩(wěn)定性和豐度在UMW-868存在的情況下發(fā)生了變化。在這55種蛋白質(zhì)中，兩種未表征的蛋白質(zhì)(分別由基因HCO_011565和HCO_014287編碼),在UMW-868存在下表現(xiàn)出高的熱穩(wěn)定性(圖2)，這表明它們是UMW-868的作用靶標(biāo)。

圖2.?兩個(gè)潛在蛋白質(zhì)靶標(biāo)的熔解曲線

隨后，作者研究了這兩個(gè)分子的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。研究發(fā)現(xiàn)HCO_011565在H. contortus的所有關(guān)鍵發(fā)育階段都有轉(zhuǎn)錄表達(dá)，在卵、L3、L4(四齡幼蟲(chóng))和成蟲(chóng)階段都有高表達(dá)。對(duì)于HCO_014287，僅在L2和L3階段記錄到中到高的轉(zhuǎn)錄水平，但在其他發(fā)育階段表達(dá)有限或沒(méi)有表達(dá)(圖3B)?；谶@些發(fā)現(xiàn)，選擇了HCO_011565作為進(jìn)一步的研究對(duì)象。

圖3.?HCO_011565的分子表征及與UMW-868的對(duì)接

藥物化學(xué)導(dǎo)致H. contortus的效力增強(qiáng)

接下來(lái)作者探究了改變其（UMW-868）化學(xué)結(jié)構(gòu)以嘗試增強(qiáng)效力。在UMW-868的“南部區(qū)域”，用噻吩取代芳基環(huán)不會(huì)改變xL3s運(yùn)動(dòng)效力（A-3126；IC50 12.1 μM）。然而，效力隨著向芳基中添加4-甲基（A3136；IC50 4.8 μM）而增加，并隨著4-三氟甲基取代（A-6501；IC50 1.6 μM）而進(jìn)一步增強(qiáng)。在“北部區(qū)域”（R2），用乙氧基取代正丙基提高了效力（A-3134；IC50 7.8 μM），并通過(guò)引入4-二氟甲氧基進(jìn)一步增強(qiáng)了效力（A- 4340；IC50 4.0 μM）。根據(jù)xL3s活力降低的結(jié)果，其中一些修飾類(lèi)似物（即?A-3136、A-6318、A-6501和?A-4340）增強(qiáng)了對(duì)幼蟲(chóng)發(fā)育的抑制效力。

圖4. MW-868及其類(lèi)似物對(duì)H. contortus的活性評(píng)價(jià)

總結(jié)

該研究基于高通量表型篩選，確定了一種候選驅(qū)蟲(chóng)藥物?(UMW-868)，它對(duì)H. contortus和至少三種其他線蟲(chóng)物種具有可重復(fù)且非常有效的殺蟲(chóng)活性。使用熱蛋白質(zhì)組學(xué)分析(TPP)，在H. contortus中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的蛋白質(zhì)靶標(biāo)（命名為?HCO_011565），它與UMW-868具有相互作用。該研究建立的工作流程：將體外篩選、效力評(píng)估和TPP指導(dǎo)的蛋白質(zhì)靶標(biāo)識(shí)別與計(jì)算機(jī)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和配體對(duì)接相結(jié)合，可能是一種有用的工具，可支持發(fā)現(xiàn)新型驅(qū)蟲(chóng)藥和匹配目標(biāo)候選物以進(jìn)行優(yōu)先排序和后續(xù)評(píng)估。鑒于世界范圍內(nèi)具有重要農(nóng)業(yè)和獸醫(yī)意義的線蟲(chóng)普遍存在驅(qū)蟲(chóng)藥耐藥性問(wèn)題，這具有重大意義。

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