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“真”單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)，“真”不是吹的
01?“真”單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)引領(lǐng)者
2019年8月12日，Nature Methods編輯Vivien Marx在Nature Methods上在線發(fā)表了題為“A dream of single-cell proteomics”的文章，蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域的領(lǐng)軍人物之一蘇黎世聯(lián)邦理工學(xué)院Ruedi Aebersold教授在文章中評(píng)論到“It’s early days, but it’s not a distant dream to be able to tally the proteins in single cells” 。巧合的是，2019年也是基于timsTOF Pro的4D-蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)開(kāi)始騰飛的一年。
圖1：?jiǎn)渭?xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)的夢(mèng)想不再遙遠(yuǎn)
2020年12月蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域兩大領(lǐng)軍科學(xué)家Matthias Mann團(tuán)隊(duì)（Max Planck Institute of Biochemistry)和Ruedi Aebersold團(tuán)隊(duì)（ETH Zurich）在Nature Methods發(fā)表題為“diaPASEF: parallel accumulation–serial fragmentation combined with data-independent acquisition”的文章，其共同開(kāi)發(fā)的基于4D平臺(tái)的DIA技術(shù)——diaPASEF，能夠全面提升蛋白質(zhì)鑒定覆蓋率、重現(xiàn)性和定量準(zhǔn)確性。因此，4D-DIA技術(shù)大幅提升的可靠性，之前不太被大家認(rèn)可的DIA（數(shù)據(jù)非依賴性采集）技術(shù)真正開(kāi)始大步向前，也是從此刻開(kāi)始，4D-蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展一發(fā)不可收拾。
圖2：timsTOF SCP開(kāi)啟“真”單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)
02??“真”單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜進(jìn)化到第二代，可以上車(chē)了
2023年6月5日，在第71屆ASMS會(huì)議上，布魯克公司繼續(xù)在“真”單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)上發(fā)力，重磅發(fā)布了timsTOF Ultra，“真”單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜發(fā)展到第二代。timsTOF Ultra配備新型Captive Stray（CSI）Ultra離子源，第四代TIMS（捕集離子淌度）XR離子淌度和14位數(shù)模轉(zhuǎn)換器，MSMS掃描速度提升到300Hz，繼續(xù)占據(jù)MSMS掃描速度的頭把交椅。
圖3：成熟可復(fù)制的單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)解決方案
以HeLa細(xì)胞為例，人們一般認(rèn)為單個(gè)細(xì)胞的蛋白質(zhì)含量為200-250pg，于是有人將250 pg的進(jìn)樣量的蛋白鑒定數(shù)目等價(jià)于單細(xì)胞蛋白質(zhì)組鑒定數(shù)目，但實(shí)際上系列稀釋樣本可以用來(lái)部分表現(xiàn)儀器靈敏度，無(wú)法代表真正單個(gè)細(xì)胞蛋白鑒定水平，“真”單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)的數(shù)據(jù)才是檢驗(yàn)質(zhì)譜靈敏度的唯一標(biāo)準(zhǔn)。
布魯克公司在第一代“真”單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜timsTOF SCP上積累的寶貴經(jīng)驗(yàn)和技術(shù)，在第二代timsTOF Ultra上完全得到了釋放，通過(guò)CellenOne對(duì)HeLa細(xì)胞分選，獲取1個(gè)、5個(gè)和10個(gè)細(xì)胞，采用dia-PASEF方法進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，Spectronaut 18數(shù)據(jù)分析，單個(gè)細(xì)胞22min可以鑒定超過(guò)3700種蛋白質(zhì)（每個(gè)樣本3針重復(fù)），1個(gè)HeLa細(xì)胞兩次重復(fù)所鑒定的蛋白質(zhì)強(qiáng)度相關(guān)系數(shù)>0.95，顯示出低至1個(gè)細(xì)胞的進(jìn)樣量也能得到高重復(fù)性。
圖4：“真”單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)
德國(guó)柏林馬克斯·德?tīng)柌紖慰朔肿俞t(yī)學(xué)中心空間蛋白質(zhì)組學(xué)研究小組負(fù)責(zé)人Fabian Coscia博士采用第一代“真”單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜timsTOF SCP進(jìn)行FFPE組織的單細(xì)胞分析，單個(gè)肝細(xì)胞當(dāng)量的組織可以定量1500-2000種蛋白質(zhì)。timsTOF Ultra靈敏度的提升，必將在FFPE組織的單細(xì)胞分析中發(fā)揮更強(qiáng)大的威力。
圖5：timsTOF SCP進(jìn)行FFPE組織的單細(xì)胞分析
03? ?“真”單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)主打“成熟可復(fù)制”
單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究是一項(xiàng)復(fù)雜而前沿的科研領(lǐng)域，涉及許多挑戰(zhàn)和門(mén)檻，比如用什么技術(shù)進(jìn)行單個(gè)細(xì)胞的分選、分選后對(duì)單個(gè)細(xì)胞操作時(shí)怎么盡可能將低樣本損失、質(zhì)譜的靈敏度能否達(dá)到單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)所需靈敏度，這些挑戰(zhàn)和門(mén)檻讓很多研究者對(duì)單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)望而卻步。布魯克推出的一套完整的“真”單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)方案，把單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究的這些挑戰(zhàn)和門(mén)檻全部打破，主打一個(gè)“成熟可復(fù)制”，甚至沒(méi)有蛋白質(zhì)組學(xué)經(jīng)驗(yàn)的人也可以快速上手，短時(shí)間內(nèi)就可產(chǎn)生高質(zhì)量單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)。
在布魯克上海Demo中心完成timsTOF Ultra裝機(jī)之后，我們迅速建立起了單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法，具備了單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)測(cè)試能力，并完成了“真”單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)的樣本測(cè)試。采用CellenOne分選單個(gè)293T細(xì)胞，采用標(biāo)準(zhǔn)dia-PASEF采集方法，15min之內(nèi)平均每個(gè)293T細(xì)胞可以鑒定3971種蛋白質(zhì)，不僅重現(xiàn)了在布魯克德國(guó)研發(fā)中心的結(jié)果，并且把測(cè)試時(shí)間縮短為原來(lái)的50%。
圖6：“真”單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)
小結(jié)
得益于質(zhì)譜技術(shù)的進(jìn)步，單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域?qū)⒑芸煊瓉?lái)爆發(fā)，布魯克timsTOF Ultra的發(fā)布，必將成為單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域爆發(fā)的強(qiáng)勁動(dòng)力。timsTOF Ultra超越了傳統(tǒng)的限制，為新的科學(xué)可能性打開(kāi)了大門(mén)。無(wú)論是單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)、免疫肽組學(xué)或者血漿蛋白質(zhì)組學(xué)，timsTOF Ultra提供了無(wú)與倫比的掃描速度和靈敏度，幫助研究人員打破工作的界限并取得突破性成果
參考文獻(xiàn)
1.Marx, V. A dream of single-cell proteomics. Nat Methods 16, 809–812 (2019).?
2.Meier, F., Brunner, AD., Frank, M. et al. diaPASEF: parallel accumulation–serial fragmentation combined with data-independent acquisition. Nat Methods 17, 1229–1236 (2020).?
3.Brunner, AD., Thielert, M., Vasilopoulou? C. et al. Ultra-high sensitivity mass spectrometry quantifies single-cell proteome changes upon perturbation. Molecular Systems Biology (2022)18:e10798?
4.Makhmut, A., Qin, D., Fritzsche, S., et al. A framework for ultra-low input spatial tissue proteomics. bioRxiv 2023.05.13.540426
