1．了解PCR-DGGE技術(shù)的原理。 2．了解并熟悉PCR-DGGE技術(shù)的步驟。

【實(shí)驗(yàn)原理】 變性梯度凝膠電泳（DGGE）是一種根據(jù)DNA片段的熔解性質(zhì)而使之分離的凝膠系統(tǒng)。核酸的雙螺旋結(jié)構(gòu)在一定條件下可以解鏈，稱(chēng)之為變性。核酸50%發(fā)生變性時(shí)的溫度稱(chēng)為熔解溫度（Tm）。Tm值主要取決于DNA分子中GC含量的多少。DGGE將凝膠設(shè)置在雙重變性條件下：溫度50~60 ℃，變性劑0~100%。當(dāng)一雙鏈DNA片段通過(guò)一變性劑濃度呈梯度增加的凝膠時(shí)，此片段遷移至某一點(diǎn)變性劑濃度恰好相當(dāng)于此段DNA的低熔點(diǎn)區(qū)的Tm值，此區(qū)便開(kāi)始熔解，而高熔點(diǎn)區(qū)仍為雙鏈。這種局部解鏈的DNA分子遷移率發(fā)生改變，達(dá)到分離的效果。Tm的改變依賴(lài)于DNA序列，即使一個(gè)堿基的替代就可引起Tm值的升高和降低。因此，DGGE可以檢測(cè)DNA分子中的任何一種單堿基的替代、移碼突變以及少于10個(gè)堿基的缺失突變。 為了提高DGGE的突變檢出率，可以人為地加入一個(gè)高熔點(diǎn)區(qū)——GC夾。GC夾（GC clamp）就是在一側(cè)引物的5′端加上一個(gè)30~40bp的GC結(jié)構(gòu)，這樣在PCR產(chǎn)物的一側(cè)可產(chǎn)生一個(gè)高熔點(diǎn)區(qū)，使相應(yīng)的感興趣的序列處于低熔點(diǎn)區(qū)而便于分析。因此，DGGE的突變檢出率可提高到接近于100%。 作為一種突變檢測(cè)技術(shù)，DGGE具有如下的優(yōu)點(diǎn)：（1）突變檢出率高。DGGE的突變檢出率為99%以上。（2）檢測(cè)片段長(zhǎng)度可達(dá)1kb，尤其適用于100~500bp的片段。（3）非同位素性。DGGE不需同位素?fù)饺?，可避免同位素污染及?duì)人體造成的傷害。（4）操作簡(jiǎn)便、快速。DGGE一般在24小時(shí)內(nèi)即可獲得結(jié)果。（5）重復(fù)性好。但是，該方法需要特殊的 儀器 ，而且合成帶GC夾的引物也比較昂貴。

【實(shí)驗(yàn)用品】 1．PCR擴(kuò)增儀；變性梯度凝膠電泳儀；凝膠成像及分析系統(tǒng)；紫外透射儀；高速離心機(jī)；電泳儀；電泳槽。 2．尿素、去離子甲酰胺、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、瓊脂糖 3．微量加樣器（200μl，20μl）；Tip頭（200μl，20μl）。Tip頭盒（200μl，20μl）；Eppendorf管（0.5ml，0.2ml），Eppendorf管架。 4．PCR擴(kuò)增相關(guān) 試劑 。

【實(shí)驗(yàn)步驟】 1．PCR反應(yīng)（同前） 其中，上游引物加40bp [GC] Clamp。 2．PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)。 3．垂直變性梯度凝膠電泳 變性梯度遞增的方向與電泳方向垂直。所使用的膠為6%聚丙烯酰胺凝膠，變性濃度為0～100%。其中，含7 M尿素和40%去離子甲酰胺的膠為100%變性，不含尿素和去離子甲酰胺的膠為0%變性。垂直變性梯度凝膠電泳主要是檢測(cè)引物的最適解鏈條件（即變性濃度）。 PCR產(chǎn)物加上樣緩沖液后上樣，300～400μl/孔，電壓150V，溫度60℃，時(shí)間2～4小時(shí)。 4．平行變性梯度凝膠電泳 變性梯度遞增的方向與電泳方向平行。根據(jù)垂直變性梯度凝膠電泳檢測(cè)的解鏈區(qū)域的變性濃度，制備相應(yīng)變性濃度的平行變性梯度凝膠，檢測(cè)各標(biāo)本是否存在突變。 PCR產(chǎn)物加上樣緩沖液后，25μl～30μl/孔，電壓150V，溫度60℃，時(shí)間3～6小時(shí)。 5．染色5分鐘， 凝膠成像 儀分析結(jié)果。

【實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析】 觀察并記錄平行變性梯度凝膠上條帶的位置，根據(jù)異常泳動(dòng)變位篩查突變樣本。

【思考題】 1． PCR-DGGE檢測(cè)突變的基本原理是什么？ 2． 為什么要在上游5端添加[GC] Clamp？ 3． 如何確定樣品的變性梯度？