實驗步驟

實驗原理

1 PCR體系的準備和PCR擴增的開始

2.5mmol/L dNTP Mixture 4.0uL

10xbuffer Mg 2+ Ex－TaqE ddH 2 O 40uL

primer 4uL

模板DNA 2uL

94 0 C,2’ 94 0 C 1’ 42 0 C 1’ 72 0 C 2’ 72 0 C 10’ I-------30cycles----I

聚合酶 鏈式反應(Polymerase Chain Reaction)，即PCR技術(shù)。

在合適條件下，這種循環(huán)不斷重復，前一個循環(huán)的產(chǎn)物可作為后一循環(huán)的模板參與DNA的合成，最終使產(chǎn)物DNA的量按2n方式擴增。

理論上講經(jīng)過30次的循環(huán)反應，DNA擴增倍數(shù)為106-109。

PCR引物的設(shè)計至關(guān)重要， 3 ’ 端要嚴格配對，5 ’ 可以引入酶切位點 ，也可以由此控制Tm值和CG的比值。

TaqE有最適溫度和反應的活性，要注意它有加尾活性。

循環(huán)數(shù)超過30個以后，因為產(chǎn)物數(shù)量增加和反應物數(shù)量的減少，反應速度降低，這時對反映的產(chǎn)率已經(jīng)沒有貢獻，反而副產(chǎn)物增多,影響效果。所以， 循環(huán)數(shù)不應超過30 。

2 PCR產(chǎn)物電泳

0.8 %Agarose（ 1 ×TAE ） 80伏恒壓電泳

全部PCR產(chǎn)物上樣電泳：

6uL 10xloading

6uL SYBR

marker部分：

10uL marker（含loading buffer）

1uL SYBR

因為PCR產(chǎn)物會有一些副產(chǎn)物，所以要用電泳的方法分離各種PCR產(chǎn)物。這樣也能分離TaqE等雜質(zhì)。

為了分辨PCR產(chǎn)物和PCR副產(chǎn)品，需要跑一個 分子量marker ，我們的產(chǎn)物是1.6kp。

用TAE的原因是高嚴可以降低Agarose熔點，促進之后的DNA 吸附。

3 PCR產(chǎn)物的回收（玻璃奶吸附法）

1)

紫外燈下切膠，稱膠重

SYBR會使DNA部分顯出綠色熒光，在紫外燈下辨認綠色熒光，可將膠切下。

2)

每100mg 膠加入300 uL 溶膠液 ，50 o C溶膠

讓DNA充分釋放到液體中。

3)

將在-20 o C凍存的玻璃奶解凍， 振勻 ??！

玻璃奶為細微的玻璃小顆粒，因酷似奶狀而得名。它為懸濁液，而可以起吸附作用的小顆粒會沉降下來，所以，只有搖勻，我們才能渠道足量的玻璃小顆粒，完成分離的過程。

4)

在溶解后的膠液中加入10 uL玻璃奶，吹打均勻，冰浴沉淀10min， 10,000rpm離心1min，去上清。

這是一個類似于 吸附層析 的過程。DNA會特異的吸附于玻璃奶的小顆粒上，而膠不會吸附于其上，故可以起到分離的效果。

高鹽能促進吸附。

5)

在離心所得沉淀中加入200 uL稀釋濃縮洗膠液（3體積濃縮洗膠液加入7體積無水乙醇即得稀釋液），吹打均勻，10,000rpm離心1min，去上清，如此洗兩次。

這是一個 洗滌 的過程。

6)

50 0 C干燥。

7)

加入20 uL TE，吹打均勻，60 o C 5-10min 溶解DNA，12,000rpm 2min，收集上清為回收的PCR產(chǎn)物，-20 o C保存。

此步驟是 解析 。

讓DNA釋放到溶液中，李新的方法可以將DNA純化。

低鹽有利于解吸附。

8)

檢測是否含有DNA

取2uLDNA混合0.5uLSYBR，直接到紫外燈下觀察，若有綠色熒光，則證明有DNA存在。