生物藥蛋白的異構(gòu)體分析

丹納赫生命科學(xué)

2022.1.21

蛋白類藥物具有的翻譯后修飾，如糖基化、N末端的焦谷氨酸化、C末端的賴氨酸截除、氧化、脫酰胺等，這些不同的翻譯后修飾組合可使蛋白分子產(chǎn)生無數(shù)種電荷異構(gòu)體。另外，單抗在特定的條件下會發(fā)生降解、斷裂，形成低分子量的片段。這些異構(gòu)體對于蛋白藥物的穩(wěn)定性及生物學(xué)功能發(fā)揮具有重要影響，需要用合適的方法進(jìn)行分析。

丹納赫生命科學(xué)擁有用毛細(xì)管電泳法（CE）檢測單抗的純度及蛋白電荷異構(gòu)體的解決方案。

1CE-SDS進(jìn)行單抗純度及大小變異體的檢測。

CE-SDS蛋白凝膠電泳是采用液態(tài)凝膠作為篩分介質(zhì)，根據(jù)不同分子量大小的樣品在凝膠中不同的遷移時間將其區(qū)分，從而進(jìn)行大小變異體檢測。

將單抗與 β-巰基乙醇或碘乙酰胺混勻進(jìn)行前處理后，進(jìn)行還原及非還原的純度分析。該方法有兩種分析分離的模式，分別為高分辨率（High Resolution, HR）和快速（High Speed, HS）模式。HR下樣品從進(jìn)口端到檢測窗口的距離為20.0 cm。HS下樣品從進(jìn)口端到檢測窗口的距離為10.2 cm。HS模式的分辨率略有下降，但是相比HR模式能夠帶來更快速的分析（HS大約需要15 min，HR大約需要30 min）。

通過還原處理，可得到單抗的輕鏈、非糖基化重鏈以及重鏈，其中非糖基化重鏈和重鏈能夠達(dá)到基線分離。在非還原法中，得到了輕鏈、重鏈、二重一輕鏈、非糖基化的IgG以及IgG主體。

HR電泳模式? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? HS電泳模式

另外，還可以用激光誘導(dǎo)熒光 (LIF)的檢測方式，對單抗分子大小異構(gòu)體進(jìn)行高靈敏的檢測，靈敏度可比UV高10倍。

UV（紫外）下與LIF下對同一個單抗進(jìn)行CE-SDS的電泳圖譜

2等電點及電荷異構(gòu)體的檢測

毛細(xì)管電泳儀可以采用等電聚焦電泳（Capillary Isoelectric Focusing, cIEF）及區(qū)帶電泳（Capillary zone electrophoresis CZE）兩種方式對蛋白電荷異構(gòu)體進(jìn)行表征。

在cIEF的分離過程中，毛細(xì)管左右兩端施加的高壓電場使得陽極液和陰極液中的氫離子和氫氧根離子相向運動，其內(nèi)部填充的兩性電解質(zhì)在酸性（陽極）溶液和堿性（陰極）溶液所形成電場的作用下形成連續(xù)的pH梯度，從而使得兩性化合物向各自等電點（pI）遷移，可以得到不同電荷異構(gòu)體的峰。

采用同一種分離方法，CE能夠在寬pH范圍內(nèi)對多種單抗進(jìn)行cIEF分析。此種方法使用三種PI marker，等電點計算值更加準(zhǔn)確；分離使用30cm長的毛細(xì)管，能夠獲得較高的分辨率。

? ? ? ? ? 三種單抗CIEF電泳圖? ? ? ? ? ? ?一種單抗的六種CIEF重復(fù)性結(jié)果?

cIEF是一種根據(jù)蛋白各亞型等電點的變化分離電荷異構(gòu)體的方法，需要在涂層毛細(xì)管中進(jìn)行聚焦和遷移，分辨率高，但是分析時間較長，因此還可以采用區(qū)帶電泳CZE的模式快速對蛋白電荷異構(gòu)體進(jìn)行分析。可使用EACA作為兩性電解質(zhì)，TETA作為動態(tài)涂層，HPMC作為篩分基質(zhì)對蛋白的電荷異構(gòu)體進(jìn)行分離，只需12分鐘就可得到高分辨率和高重現(xiàn)性的分離結(jié)果。

? ? ? ? ? ? ? ? 單抗CZE 分離結(jié)果? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?9針單抗CZE分離結(jié)果

PA 800 Plus 毛細(xì)管電泳制藥分析系統(tǒng)配有UV、PDA、LIF三種檢測器，配合IgG純度分析試劑盒，cIEF 等點聚焦試劑盒和CZE試劑盒可進(jìn)行單抗純度、蛋白等電點及電荷異構(gòu)體分析，另外PA 800 Plus具有專利的循環(huán)冷卻控溫系統(tǒng)可使結(jié)果的重復(fù)性和穩(wěn)定性更佳。