蔣　敏1 , 賈文祥3 , 陳　嵐1 , 周　偉1 , 李文勝1 , (1. 四川大學(xué)華西第二醫(yī)院, 四川成都610041 ; 2. 四川大學(xué)華西醫(yī)院, 四川成都610041 ; 3. 四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院, 四川成都610041)

摘要: 目的　建立一種多重PCR 方法,在同一擴(kuò)增體系內(nèi)同時(shí)檢測(cè)淋病奈瑟球菌及其青霉素、四環(huán)素耐藥基因, 探討采用多重PCR 同時(shí)檢測(cè)淋菌及其耐藥基因的可行性。方法　根據(jù)淋菌CPPB、TeM21、Tet2M基因序列,分別設(shè)計(jì)了3 對(duì)引物,并在同一擴(kuò)增體系內(nèi)行PCR 擴(kuò)增,擴(kuò)增的靶序列分別為150 bp 、224 bp 、316 bp 。結(jié)果　淋菌及其青霉素、四環(huán)素耐藥的標(biāo)準(zhǔn)菌株,上述3 個(gè)基因位點(diǎn)的檢測(cè)均為陽(yáng)性,對(duì)125 例臨床標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行傳統(tǒng)培養(yǎng)、藥敏和多重PCR 檢測(cè),結(jié)果顯示淋菌的檢出率:培養(yǎng)法為20. 0 % ,PCR 法為24. 8 %;PPNG檢出率:藥敏法為16. 0 % ,PCR法為20. 8 ;TRNG檢出率:藥敏法為14. 4 % ,PCR 法為19. 2 %。結(jié)論　該法與傳統(tǒng)的培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)相比具敏感、特異、迅速、標(biāo)本不受淋菌存活以及藥敏試驗(yàn)諸多因素的影響,是一種簡(jiǎn)便、快速、可靠的方法。 關(guān)鍵詞: PCR; 淋病奈瑟球菌; 耐藥基因 中圖分類(lèi)號(hào): R759. 2 　　文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼: A 　　文章編號(hào): 100524529 (2005) 0120023203

　自20 世紀(jì)80 年代以來(lái),淋病已成為我國(guó)發(fā)病率較高的性傳播疾病,而淋病奈瑟球菌(簡(jiǎn)稱(chēng)淋菌)的耐藥性日益增多,給淋病治療帶來(lái)新的問(wèn)題。淋菌對(duì)抗生素的耐藥性可由質(zhì)粒、染色體或二者共同介導(dǎo)1 。自1976 年和1985 年美國(guó)等先后分離出耐青霉素淋菌(PPNG) 和高度耐四環(huán)素淋菌(TRNG) 以來(lái),許多國(guó)家都有大量文獻(xiàn)報(bào)道淋菌及耐藥性問(wèn)題。雖然青霉素和四環(huán)素不再作為治療淋病首選藥物,但PPNG、TRNG的檢測(cè)仍是淋菌耐藥性流行病學(xué)監(jiān)測(cè)中的重要指標(biāo)之一,傳統(tǒng)的方法主要靠培養(yǎng)鑒定及藥敏試驗(yàn),步驟復(fù)雜,周期長(zhǎng),易受標(biāo)本采集、運(yùn)輸、保存以及患者病情、治療情況等因素影響,不利于PPNG、TRNG株的快速檢出和淋病的早期診斷和治療。1994 年,Ogunrinu 報(bào)道了用兩對(duì)引物在同一擴(kuò)增體系內(nèi)同時(shí)檢測(cè)淋菌和耐青霉素基因,郭露等2 建立了淋菌TRNG 株的PCR 檢測(cè)方法,陳斌等3 采用兩對(duì)引物套式PCR 檢測(cè)PPNG,我們?cè)诖嘶A(chǔ)上進(jìn)行了進(jìn)一步探討,即用3 對(duì)引物在同一擴(kuò)增體系內(nèi)同時(shí)檢測(cè)淋菌及耐青霉素基因(TeM21) 、耐四環(huán)素基因(Tet2M) ,并與傳統(tǒng)培養(yǎng)和藥敏法進(jìn)行比較,為臨床早期快速檢測(cè)淋菌及其耐藥性研究提供依據(jù)。 1 　材料與方法 1. 1 　材料 1. 1. 1 　菌株來(lái)源　臨床分離與鑒定的淋菌雙重耐藥菌株由四川大學(xué)華西醫(yī)院皮膚科性病實(shí)驗(yàn)室和我院性病門(mén)診患者泌尿生殖道分泌物中分離得到,標(biāo)準(zhǔn)菌株A、B、C 由四川省皮膚病研究所提供。 1. 1. 2 　培養(yǎng)基和藥敏　淋菌培養(yǎng)基為廣州樂(lè)通泰公司提供,青霉素及四環(huán)素藥敏紙片為法國(guó)生物梅里埃公司提供。 1. 1. 3 　PCR 試劑 　由成都進(jìn)取公司提供,引物由北京賽百盛公司合成,PCR 擴(kuò)增儀為美國(guó)PE 公司的PE9600 ,3 對(duì)引物設(shè)計(jì)分別為: 第1 對(duì)引物: 淋菌CPPB 基因,擴(kuò)增產(chǎn)物150 bp , 5′-CATTGCCCAACGTGCCGACCT-3′ 5′-GAGACTTTGACCCGACAGAAGAC-3′ 第2 對(duì)引物: TeM21 基因,擴(kuò)增產(chǎn)物224 bp ,耐青霉素 5′-GATGCTGAAGATCAGTTGGGT-3′ 5′- GTGACTGGTGAGTACTCAAA-3′ 第3 對(duì)引物: Tet2M基因,擴(kuò)增產(chǎn)物316 bp ,耐四環(huán)素 5′-GGATTGATAACCTTATAGAAGT-3′ 5′- TTTGTATCTCCAAGAACACTAT-3′